高分子印迹固相萃取法测定熏烤肉制品中16-种欧盟优控多环芳烃.pdf

第 4 卷 第 3 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.4 No.3 2013 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2013 基金项目:江苏省科技厅科技支撑计划项目(BE2010745)、江苏省“十二五”科技兴卫工程(ZX201109)Fund:Supported by Jiangsu Provincial Science-technology Support Plan(BE2010745)and Jiangsu Provincial Health Development Project with Science and Education(ZX201109)*通讯作者:马永建,主任技师,主要研究方向为食品安全检测。E-mail:*Corresponding author:MA Yong-Jian,Chief Technician,Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention,No.172,Jiangsu Road,Gulou District,Nanjing 210009,China.E-mail: 高分子印迹固相萃取法测定熏烤肉制品中 16 种欧盟优控多环芳烃 朱 琳1,杨 润2,马永建1,2*,刘华良2(1.东南大学公共卫生学院,南京 210009;2.江苏省疾病预防与控制中心,南京 210009)摘摘 要要:目的目的 建立高分子印记固相萃取-气相色谱质谱联用(MIPSPE-GC/MS)测定熏烤肉中 16 种欧盟优控多环芳烃(PAHs)的检测方法。方法方法 样品经均质、超声波提取、高分子印记固相萃取柱净化后,采用气相色谱质谱联用仪在选择离子(SIM)扫描模式下进行测定,内标法定量。结果结果 本方法检出限为 0.070.24 g/kg,在1500 g/L 范围内目标化合物具有很好的相关性,相关系数均大于 0.999。日内及日间精密度小于 10%,在 1、5 g/kg 两个加标水平下,16 种 PAHs 回收率为 64.24%111.61%,相对标准偏差均小于 10%。结论结论 本方法灵敏、快速、简便,能满足熏烤肉制品中欧盟多环芳烃的检测要求。关键词关键词:多环芳烃;熏烤肉;高分子印记固相萃取;气相色谱-质谱法 Determination of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons with European priority in smoked meat by molecularly imprinted solid-phase extraction ZHU Lin1,YANG Run2,MA Yong-Jian1,2*,LIU Hua-Liang2(1.School of Public Health,Southeast University,Nanjing 210009,China;2.Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention,Nanjing 210009,China)ABSTRACT:Objective To establish a method for the determination of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)with European priority in smoked meat by molecularly imprinted solid-phase extraction and gas chroma-tography-mass spectrometry(MIPSPE-GC/MS).Methods The homogenized sample was extracted ultrasonically with cyclohexane,cleaned up by molecularly imprinted solid-phase extraction catridge(MIPSPE),analyzed by GC/MS under the positive mode using selected ion scan(SIM).The samples were quantified with internal standard method.Results The detection limits of 16 PAHs were 0.070.24 g/kg,The method showed a good linearity over the range of 1500 g/L for 16 PAHs with R0.999.The intra-and inter-day precision was less than 10%.The re-coveries of spiked samples at the level of 1 g/kg and 5 g/kg were in the range of 64.24%111.61%,and the rela-tive standard deviations were all less than 10%.Conclusion This method is quick,sensitive and suitable for the de-termination of 16 PAHs with European priority.KEY WORDS:polycyclic aromatic hydrocarbons;smoked meat;molecularly imprinted solid-phase extraction;gas chromatography-mass spectrometry 912 食品安全质量检测学报 第 4 卷 1 引 言 多 环 芳 烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指由两个及两个以上苯环以稠环形式相连的一类持久性有机污染物,有四个及四个以下苯环的属轻质多环芳烃,多于四个苯环的属重质多环芳烃。因 PAHs 对人类具有潜在的致癌性和致畸性1,环境样品和食品中 PAHs 的检测都备受关注。针对存在于熏烤肉中的多环芳烃种类,近两年欧盟提出了应优先关注的16种多环芳烃(简称为16 EU PAHs),并提出 835/2011/(EC)法规2,规定苯并a芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽和 总和限量为 30 g/kg。相对于由美国环保局(EPA)规定的 16 种多环芳烃(简称为 16 EPA PAHs),16 EU PAHs剔除了 EPA优控中的轻质多环芳烃,新增了更多重质多环芳烃。目前,在熏烤肉制品 16 EU PAHs 的前处理方法中,采用较多的是索氏提取法3,4或加压液体萃取法5,6提取脂肪,再经过液液萃取及固相萃取进一步净化,检测方法主要有高压液相色谱-荧光检测法(HPLC-FID)或气相色谱-质谱法(GC-MS)。以上的方法各具优点但仍存在不足,如传统液液萃取和 GPC的方法繁琐、费时且溶剂消耗量大;加压液体萃取法的仪器设备昂贵,较难普及。由多数重质多环芳烃组成的 16 EU PAHs 的定量检测存在如下困难:因环戊cd芘不具荧光吸收,故使用 HPLC-FID 定量检测时需用紫外检测器进行再次分析;使用 GC/MS 法时,某些同分异构体在传统非极性柱上无法完全分开,同时分子量较大的多环芳烃存在响应信号强度歧视现象,导致它们的检出限增加7。本研究首次报道以超声法提取以及商品化高分子印迹固相萃取柱直接处理熏烤肉制品,采用专用气相色谱柱定量检测 16 EU PAHs。2 材料与方法 2.1 仪器与试剂 7890/5975C 气相色谱/质谱联用仪(美国 Agilent公司);氮吹浓缩仪(美国 Organomation 公司);TI-H25超声清洗仪(德国 Elma 公司);Buchi R210 旋转蒸发仪(瑞士 Buchi 公司);固相萃取装置和 SupelMIP 52773-U 固相萃取小柱(3 mL,50 mg,美国 Supelco公司)。15 种多环芳烃混合标准品:苯并a蒽、5-甲基、苯并b荧蒽、苯并j荧蒽、苯并k荧蒽、苯并g,h,i苝、苯并a芘、二苯并a,h蒽、二苯并a,e芘、二苯并a,h芘、二苯并a,i芘、二苯并a,l芘、茚并1,2,3-cd芘、环戊cd芘,每种物质浓度为 10 mg/L 的乙腈溶液,1mL;苯并c芴,浓度为 10 mg/L的乙腈溶液,10 mL(德国 Dr.Ehrenstorfer Gmbh 公司)。内标标准品:氘代十二,浓度为 10 g/mL 的乙腈溶液,10 mL;氘代十二苯并a芘,浓度为 10 mg/L的乙腈溶液,1 mL(德国 Dr.Ehrenstorfer Gmbh 公司);氘代十四二苯并a,i芘,5 mg(加拿大 CDN 公司)。称取16 种 PAHs 混合标准品和 3 种内标混合标准品,用乙酸乙酯稀释成浓度均为 1 mg/L 的混合标样储备液和混合内标储备液,置于 4 条件下避光保存。环己烷、乙酸乙酯(色谱纯,美国 Tedia 公司)。2.2 样品净化 超声法提取:准确称取 3 g 绞碎均匀后的样品于50 mL 离心管中,加入 5 g 无水硫酸钠充分搅拌,然后加入 10 mL 环己烷,匀浆处理 2 min,超声提取 5 min,5000 r/min 离心 2 min,收集上清液于 50 mL 茄形瓶中,残渣分别用 6 mL 环己烷重提两次,合并环己烷提取液,用旋转蒸发浓缩到 2 mL。高分子印记固相萃取法(MIP-SPE)净化:以 1 mL环己烷淋洗高分子印迹固相萃取小柱,保持柱润湿,将 1 mL 提取液移至小柱上,上样速度应控制小于 1 mL/min,再用 1 mL 环己烷淋洗小柱,去除杂质,此步骤速度应在 0.51 mL/min。最后用 3 mL 乙酸乙酯分 3次洗脱,洗脱速度保持在 0.5 mL/min,收集洗脱液,氮吹至近干。加 20 L 1 mg/L 混合内标溶液,再加 180 L 乙酸乙酯涡旋混溶,待 GC/MS 定量分析。2.3 基质匹配标准溶液的配制 对空白样品(未经熏烤的生鲜肉)按 2.2 节进行前处理,将得到的洗脱液作为溶剂,将混合标样储备液进一步稀释,配制浓度为 1、5、10、50、100、500 g/L的系列基质匹配标准溶液,并在每一浓度均添加 100 g/L 的混合内标液。2.4 色谱质谱条件 Agilent JW DB-EUPAH 色谱柱(20 m0.18 mm0.14 m);柱始温 70 保持 0.8 min,以 70/min 升温至 200,2.5/min 升温至 225,3 第 3 期 朱 琳,等:高分子印迹固相萃取法测定熏烤肉制品中 16 种欧盟优控多环芳烃 913 /min 升温至 266,5/min 升温至 300,15/min 升温至 315,保持 6 min;进样口温度为325;不分流进样,进样 1 L,0.8 min 后开启分流阀,分流流量为 60 mL/min;进样口衬管和石英棉均硅烷化;载气:高纯氦,柱流量 1.7 mL/min;开启痕量离子检测。传输线温度为 330;四级杆温度为 180;EI源,温度300,电离能量70 eV;增益系数3;全扫描 50550 m/z;溶剂延迟 6 min。选择离子扫描参数见表 1。3 结果与讨论 3.1 色谱柱的选择及条件优化 DB-5MS 毛细管色谱柱无法实现 16 EU PAHs 的完全分离,如苯并b荧蒽、苯并j荧蒽、苯并k荧蒽这3种同分异构体无法完全分开,很多文献在定量时都只计算其总量;苯并a蒽和环戊cd芘不能完全分离;茚并1,2,3-cd芘和二苯并a,h蒽也较难分离,经过条件优化,能够实现基本分离8。Agilent JW DB-EUPAH 色谱柱很好地解决了以上分离问题,但持续的高温色谱条件会影响进样口的稳定性,导致仪器日间精密度变差,重质多环芳烃受此影响更明显。本实验考虑到多环芳烃在苛刻的色谱条件下有基质效应,即用基质加标法定量改善仪器日间精密度,取得了较好的效果。在软件中设置增益系数以提高目标化合物的绝对响应,并且开启痕量离子检测来降低噪音,提高灵敏度。按 2.4 所列条件进样,SIM 模式下,1 mg/L 16 EU PAHs 混合标样的总离子流见图 1。3.2 方法线性范围和检出限 以基质加标匹配标准溶液按 2.4 方法检测。以各物质定量离子响应峰面积与内标物定量离子响应峰面积之比为纵坐标,各物质浓度为横坐标,绘制线性曲线,并进行线性回归计算。结果表明,各物质浓度在 1500 g/L(相当于 1 g 熏烤肉样品中各物质质量浓度为 0.13 66.67 g/kg)范围时与峰面积呈现良好的线性关系,相关系数均大于 0.999,结果见表 2。配制接近方法检出限的标准样品,重复 7 次,以 3 倍信噪比作为方法检出限(LOD),结果见表 1。16 种 PAHs的 LOD 为 0.070.24 g/kg。苯并a芘及其与苯并a 蒽、苯并b荧蒽、的含量总和均低于国内与欧盟标准的限量值。图 1 16 种欧盟多环芳烃混合标样 SIM 模式下总离子流图 Fig.1 Total ion chromatograms of 16 EU PAHs(SIM acquisition)注:1.苯并c芴(benzo c fluorine,BcF);2.苯并a蒽(benz a anthracene,BaA);3.环戊cd芘(cyclopenta cd pyrene,CPP);4.(chrysene,CHR);5.5-甲基(5-methyl chrysene,5MC);6.苯并b荧蒽(benzo b fluoranthene,BbF);7.苯并k荧蒽(benzo k fluoranthene,BkF);8.苯并j荧蒽(benzo j fluoranthene,BjF);9.苯并a芘(benz a pyrene,BaP);10.茚并1,2,3-cd芘(indeno 1,2,3-cd pyrene,IcP);11.二苯并a,h蒽(dibenzo a,h anthracene,DhA);12.苯并g,h,i苝(benzo g,h,i perylene,BgP);13.二苯并a,l芘(dibenzo a,l pyrene,DlP);14.二苯并a,e芘(dibenzo a,e pyrene,DeP);15.二苯并a,i芘(dibenzo a,i pyrene,DiP);16.二苯并a,h芘(dibenzo a,h pyrene,DhP)914 食品安全质量检测学报 第 4 卷 表 1 16 EU PAHs 及内标物质的保留时间、选择离子和检出限 Table 1 GC-retention time,representative ion and limit of detection of 16 EU PAHs and internal standards 化合物名称 缩写 保留时间(min)定量离子(m/z)定性离子(m/z)相关系数 R LOD(g/kg)使用的内标物质 苯并c芴 BcF 10.30 216 215,108 0.9998 0.09 CHRD12 苯并a蒽 BaA 14.89 228 226,229 0.9997 0.07 CHRD12 环戊cd芘 CPP 15.15 226 227,113 0.9999 0.11 CHRD12 氘代十二 CHRD12 15.20 240 CHR 15.38 228 226,229 0.9997 0.07 CHRD12 5-甲基 5MC 18.24 242 241,239 0.9997 0.09 BaPD12 苯并b荧蒽 BbF 22.04 252 253,125 0.9997 0.08 BaPD12 苯并k荧蒽 BkF 22.22 252 253,125 0.9997 0.08 BaPD12 苯并j荧蒽 BjF 22.39 252 253,126 0.9997 0.09 BaPD12 氘代十二苯并a芘 BaPD12 24.44 264 苯并a芘 BaP 24.61 252 253,125 0.9996 0.07 BaPD12 茚并1,2,3-cd芘 IcP 30.71 276 138,277 0.9997 0.10 BaPD12 二苯并a,h蒽 DhA 30.93 278 276,138 0.9997 0.14 BaPD12 苯并g,h,i苝 BgP 32.11 276 138,277 0.9997 0.13 BaPD12 二苯并a,l芘 DlP 36.23 302 300,151 0.9997 0.23 DiPD14 二苯并a,e芘 DeP 37.46 302 300,151 0.9997 0.18 DiPD14 氘代十四二苯并a,i芘 DiPD14 38.06 316 二苯并a,i芘 DiP 38.22 302 300,151 0.9997 0.24 DiPD14 二苯并a,h芘 DhP 38.67 302 300,151 0.9998 0.24 DiPD14 表 2 16 EU PAHs 的方法确证性实验 Table 2 Validation of the analysis of 16 EU PAHs 化合物名称 加标(1 g/kg,n=6)加标(5 g/kg,n=6)RSD(%)回收率 Recovery(%)RSD(%)回收率 Recovery(%)RSD(%)日内 Intra-day 日间 Inter-day 苯并c芴 85.13 2.08 85.76 1.58 1.62 5.62 苯并a蒽 83.64 3.21 78.16 2.46 0.77 2.31 环戊cd芘 97.24 6.47 84.48 3.21 2.30 2.66 83.06 3.40 74.52 8.68 1.11 2.63 5-甲基 77.72 4.08 71.56 7.55 0.70 2.38 苯并b荧蒽 77.14 3.56 65.64 7.78 1.15 1.49 苯并k荧蒽 79.71 3.18 74.72 7.76 3.00 3.84 苯并j荧蒽 77.27 2.28 72.80 4.51 2.86 3.70 苯并a芘 78.62 2.85 66.44 7.94 0.49 1.41 茚并1,2,3-cd芘 74.59 2.39 73.04 7.15 1.07 2.17 二苯并a,h蒽 70.95 3.20 70.12 7.89 0.75 1.18 苯并g,h,i苝 67.64 2.04 64.24 8.23 1.78 2.81 二苯并a,l芘 111.61 8.49 97.40 5.87 1.40 3.51 二苯并a,e芘 88.62 6.59 79.72 9.91 2.45 2.70 二苯并a,i芘 80.28 4.28 75.20 7.60 1.97 3.41 二苯并a,h芘 99.41 3.92 88.12 7.83 2.49 7.14 第 3 期 朱 琳,等:高分子印迹固相萃取法测定熏烤肉制品中 16 种欧盟优控多环芳烃 915 3.3 方法回收率与精密度 首先验证仪器的精密度,分别将浓度为 100 g/L的混合标样日内重复进样及3日内重复进样各6次,计算日内精密度和日间精密度,结果见表 2,各目标化合物的日内及日间精密度均小于 10%。以空白鲜肉为基质,在基质中分别添加 1、5 g/kg 水平的混标溶液,按 2.3 方法平行处理和测定 6 次,结果见表2,16 种目标化合物的回收率为 64.24%111.61%,相对标准偏差均小于 10%。3.4 实际样品分析 为考察方法的适用性,按本方法测定了7份自制的熏烤羊肉串,样品熏烤时间按 5 min 递增。测定结果如表 3,苯并a芘均有检出,检出量在 0.412.75 g/kg,符合我国及欧盟设定苯并a芘 5 g/kg 的限量。几种毒性特别大的六环多环芳烃均不能检出,说明在熏烤食品中不易产生这几种分子质量特别大的多环芳烃。以熏烤时间为横坐标,羊肉中苯并a芘、PAH4 和PAH16 含量为纵坐标将表 3 中的数据绘制成图 2,考察熏烤时间与肉制品中多环芳烃产生量的关系。由图 2 可知:多环芳烃含量随着熏烤时间的增加而逐渐递增,熏烤 010 min PAHs 的递增幅度最大。而消费者在街头摊贩处购得的羊肉串一般熏烤510 min 可食用,已产生了较多 PAHs。尽管所有样品中 BaP 含量都没有超过国家标准,但熏烤 30 min以上的样品,苯并a芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽和的总和PAH4 超出了欧盟设定的 30 g/kg 限量。图 2 熏烤过程中羊肉中苯并a芘、PAH4 和PAH16含量的变化 Fig.2 The changes in the contents of BaP、PAH4 and PAH16 during process of smoking in the mutton 表 3 7 个自制熏烤肉样品中多环芳烃的浓度 Table 3 PAHs concentrations in 7 self-made meat samples 含量(g/kg)5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 苯并c芴 1.52 4.99 4.44 4.43 3.75 3.34 3.66 苯并a蒽 1.73 5.53 6.16 6.72 6.38 6.95 7.34 环戊cd芘 0.33 0.96 1.68 1.33 1.53 3.96 3.69 4.19 11.76 13.35 14.76 14.72 15.41 15.30 5-甲基 N.D.0.83 0.69 0.68 0.51 0.74 0.65 苯并b荧蒽 1.48 3.79 4.24 4.16 4.62 5.19 5.67 苯并k荧蒽 0.38 0.87 0.74 0.68 0.69 1.08 1.02 苯并j荧蒽 0.69 1.57 1.62 1.68 1.41 1.98 1.87 苯并a芘 0.41 1.71 1.88 1.94 2.68 2.75 2.60 茚并1,2,3-cd芘 0.49 0.96 1.01 1.00 0.91 1.60 1.35 二苯并a,h蒽 N.D.0.28 0.34 0.32 0.28 0.33 0.35 苯并g,h,i苝 0.43 0.98 1.15 1.02 0.91 1.78 1.61 二苯并a,l芘 N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.二苯并a,e芘 N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.二苯并a,i芘 N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.二苯并a,h芘 N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.PAH4 7.81 22.79 25.64 27.58 28.39 30.31 30.91 PAH16 11.65 34.23 37.31 38.73 38.36 45.11 45.10 916 食品安全质量检测学报 第 4 卷 4 结 论 本方法灵敏、快速、环境友好,其检测限能满足国内及欧盟相关限量标准,为检测熏烤肉中 16 EU PAHs 提供了较好参考。对实际样品的检测结果说明短时间的熏烤即可产生较多量 PAHs,为食品加工过程控制提供一定依据。参考文献 1 Plaza-Bolanos 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