细胞传代和H·E染色卢文.doc

传代细胞培养以及染色
生31
卢文
2003012377
【实验目的】
1. 掌握细胞传代培养的原理和方法；
2. 掌握传代细胞染色的方法。
【实验试剂和材料】
实验用试剂
PBS缓冲液（无Ca2+、Mg2+）：pH为7.2至7.4。
培养液：DMEM+10%NBS（血清）+1%双抗（100×，即10000U/mL的青霉素与链霉素混合剂）。pH约7.2。
消化液：0.25%胰蛋白酶（trypsin）+1mmol-1EDTA混合液。
Carnoy固定液（冰醋酸:无水乙醇＝1:3），苏木精染液（苏木精0.5g，无水乙醇10mL，硫酸铝钾25g，蒸馏水150mL，完全溶解后，混合均匀，加热煮沸3－5min，加入蒸馏水至500mL，最后加入0.1g碘酸钠），伊红染液（0.5g伊红B、100mL80%乙醇），0.5%盐酸酒精溶液（0.5mL盐酸、100mL 70%乙醇），0.5%氨水。
实验材料
小平皿、自动取液器、酒精灯、火柴。
【实验步骤】
传代培养（全部步骤均在超净工作台操作）步骤：
1. 镜检，观察并记录细胞状态。
2. 吸弃培养基，加入1mL PBS溶液洗去残余培养基。
3. 加200uL胰酶－EDTA溶液，37ºC消化1－2 min。
4. 加800uL含10％血清的DMEM培养基（终止消化、悬浮细胞）。
5. 按比例分盘，进行传代培养。每盘细胞密度一致，细胞分散均匀。
6. 37ºC、5％CO2培养。
细胞染色（在实验台进行）步骤：
1. 显微镜下观察细胞形态（4×10倍），绘图。
2. 吸弃旧的培养液，用PBS荡洗一次。
3. 用Carnoy固定液固定3min。
4. 吸弃固定液，用蒸馏水荡洗一次。
5. 铁矾苏木精染色10min。
6. 用流动的自来水洗涤一次，加入0.5%的盐酸酒精溶液分色（数秒），再用流动的自来水水洗一次。
7. 加入0.5%的氨水返蓝（作用于苏木精染剂），立即弃去。
8. 用流动的自来水洗一次，观察细胞染色效果。
9. 如效果较好加入伊红溶液染色，加入数秒后立即弃去。用蒸馏水洗涤次。
10. 镜检，绘出细胞形态图并照相。
细胞生长期观察（在缓冲间进行）步骤：
细胞培养的1天后，从培养箱取出平皿，显微镜下观察细胞的数目、密度和形态情况。
【实验结果】
观察到的细胞贴壁和染色后图像见手绘图及图1。苏木精-伊红染色之后，细胞核呈紫色，细胞质呈淡粉红色。

图1：染色结果
在细胞培养的过程中，开始培养的一天后观察可见细胞已经开始增殖，镜下可见三至五个细胞团簇贴壁生长的景象。
【实验小结与讨论】
1. 传代细胞的特点：
传代细胞是指来自人或动物的肿瘤组织或者正常组织的细胞，其染色体组型发展为非整倍体或二倍体低于75%。这种非整倍体细胞在体外具有无限传代的生命力。通常具有异种移植的能力和较广泛的病毒敏感性。传代细胞的特点是：具有恒定繁殖特性，少数细胞及有繁殖能力，在琼脂内能形成克隆；染色体组型为异倍体，大多数人源细胞染色体为60-70条左右；保留种属特异性，但组织分化性和脏器特性均消失；具有致癌性。由于传代细胞繁殖迅速，易获得，易保存，为各种实验所广泛采用。
2. 影响HE染色效果的因素：
因为HE染色是依靠静电吸附原理进行染色，其影响因素如下：
固定因素：固定剂对组织有一定媒染效果，它一方面可与蛋白质相结合，同时可能与燃料相结合，故能增强着色能力；同时固定剂能沉淀和凝固蛋白质、脂肪、糖等细胞内成分，而这种沉淀及凝固关系能使细胞内成分产生不同的折光率，造成光学上的差异，使得生活情况下原来看不清的结构变得清晰起来。所以，组织固定不良师造成染色不均、灰染的主要原因。在HE染色中，固定不足或过度都容易使片子发灰，细胞结构不清晰。
固定后的水洗：在本次实验中我们采用的固定剂是卡诺固定剂即冰醋酸和无水乙醇的混合液，因此在固定后必须充分水洗去固定液，否则残留的冰醋酸时标本成酸性，将严重影响苏木精对细胞核的染色。
苏木精的染色时间：据我的看法，以5min左右为宜。
分色要适度：这是一个重要环节，若切片分化不足，细胞着色过深，使核质的分界不清楚，核不清晰；若分色过度，核太淡，反差不好。用0.5%的盐酸酒精分色，我晃晃培养皿就迅速倒出。效果还好，稍微有点偏红。
反蓝和伊红染色：这两步时间都不可太长。一般都是摇晃一下培养皿，使溶液和细胞充分接触后就迅速倒出。
3. 关于苏木精和伊红的染色原理和实验时使用的方法。
伊红B（eosin B）可以通过复染色与胞质的胶原蛋白作用从而使细胞质呈现颜色。苏木精可以对细胞核特异性染色（Fulmer和Lillie法中主要是对细胞核蛋白染色）。苏木精配方中的碘酸钠主要起到使染剂尽快成熟的作用。
由于伊红的染色原理为复染，实验中必须在用苏木精染过一次才可进行。然而如果伊红染色过深，其红色会完全覆盖掉之前用苏木精染过的细胞核的蓝色。因此可以在伊红染过一次后再用苏木精染一次，可以得到良好的效果。
4. 关于无菌操作的一些要点。
本次实验是本学期细胞生物学的最后一次实验。本次实验中我学习了日后会经常使用的无菌操作的基本要点。由于它和“有菌操作”有着很大的不同，我总结了实验中需要注意的几个要点如下：
a) 无菌操作所用的器材和样品一定不能暴露于超净工作台之外的有菌环境下。
b) 操作时手一定不可以在敞开盖子的样品上方移动。
c) 一次性用品如枪头、火柴等用过后要及时丢入废液缸，不可放置在距离样品较近的地方。
d) 应当保持超净工作台的通风良好，并且可以点燃酒精灯以制造一个小范围的绝对无菌环境。