正交试验优化神香草中的迷迭香酸和蒙花苷提取工艺_韩雪.pdf

安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb，27（2）正交试验优化神香草中的迷迭香酸和蒙花苷提取工艺韩雪，李莉，刘佳倪，刁娟娟作者单位：新疆医科大学药学院，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐830011通信作者：李莉，女，教授，博士生导师，研究方向为新疆特色药用植物研究，Email：基金项目：国家重点研究专项计划（2018YFC1708303）摘要：目的 优化神香草中的迷迭香酸和蒙花苷提取条件，确定最佳的提取工艺。方法 在单因素试验的基础上，采用超声法提取神香草中的迷迭香酸和蒙花苷，选取提取溶剂、料液比、提取时间、提取次数为主要考察因素，采用 L9（34）正交试验对迷迭香酸和蒙花苷提取工艺进行优化。结果 确定最佳提取条件，平行操作3次，神香草中迷迭香酸和蒙花苷的最佳提取工艺为提取溶剂为60%甲醇、料液比为1 20、提取时间为20 min、提取次数为1次。结论 该方法操作便捷、快速，适用于神香草中的迷迭香酸和蒙花苷的提取。关键词：神香草属植物；工艺学，制药；单因素；正交试验；迷迭香酸；蒙花苷Orthogonal test to optimize the extraction process of rosmarinic acid and buddleoside in Hyssopus officinalisHAN Xue,LI Li,LIU Jiani,DIAO JuanjuanAuthor Affiliation:School of Pharmacy,Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang Uygur Autonomous Region 830011,ChinaAbstract：Objective To optimize the extraction process of rosmarinic acid and buddleoside from Hyssopus officinalis,and to determine the best extraction method.Methods Based on a single-factor test,an ultrasonic method was used to extract rosmarinic acid and buddleoside from Hyssopus officinalis.The extraction solvent,material-to-liquid ratio,extraction time,and extraction times were selected as the main investigating factors,and the L9(34)orthogonal test was used to optimize the extraction process of rosmarinic acid and buddleoside.Results The optimum extraction conditions were determined and operated three times in parallel.The optimal extraction process for rosmarinic acid and buddleoside in Hyssopus officinalis was 60%methanol as the extraction solvent,1:20 material-to-liquid ratio,20 min extraction time,and one extraction time.Conclusion This method is convenient,rapid,and suitable for the extraction of rosmarinic acid and buddleoside from Hyssopus officinalis.Key words：Hyssopus plant;Technology,pharmaceutical;Single factor;Orthogonal test;Rosmarinic acid;Buddleoside神香草为唇形科（Labiatae）神香草属（Hyssopus L.）硬尖神香草，嫩芽可以用来制茶，其茶具有帮助脂肪分解、消化的功效，叶也常常被用于烹调食物1。神香草挥发油中主要含有莰烯、蒎烯、蒎莰酮等成分2-6，被广泛应用于化妆品、化工及食品香料等行业。此外神香草应用最普遍的是其药用价值，是维吾尔民间常用中药材，也是寒喘祖帕颗粒和罗欧咳祖帕的主要成分之一，野生神香草主要生长在新疆的阿勒泰等地，收载于 中国植物志7、中华人民共和国卫生部药品标准等，主治功能为化痰、止咳、祛风寒、杀菌，用于治疗咳嗽、头疼、哮喘及寒性引起的感冒8-9。部颁标准中只记载神香草的形状等特征，对其鉴别检查、含量测定均无明确规定。相关文献报道，神香草中含有丰富的化学成分，主要包括挥发油、萜类、黄酮、酚酸、多糖等 10-14，其中酚酸类成分迷迭香酸具有杀菌、抗炎、调节免疫及抗衰老的功效15-16。蒙花苷属于黄酮类化合物，可以抗菌消炎 17-18、并对慢性气管炎有一定疗效。前期课题组证实迷迭香酸和蒙花苷抗炎平喘的作用，同时又可以与市场中常出现的混淆品大苞荆芥加以区分，因此将迷迭香酸和蒙花苷作为本次实验的指标成分。正交试验设计是分式析因设计的方法之一，在研究多因素多水平的同时是寻求二者较优组合的一种简单、高效、迅速的方法19。本研究自2021年35月结合单因素试验的结果，采用L9（34）正交试验优化神香草中迷迭香酸和蒙花苷的提取工艺，并采用高效液相色谱法测定神香草中的主要成分迷迭香酸及蒙花苷的含量，为后续研究提供最优工艺条件，对其质量控制提供前期基础。药物分析引用本文：韩雪，李莉，刘佳倪，等.正交试验优化神香草中的迷迭香酸和蒙花苷提取工艺 J.安徽医药，2023，27（2）：251-254.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.02.009.251安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb，27（2）1仪器与药材试剂1.1仪器数控超声波清洗器（KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司），电子天平（AL-104，梅特勒-托利多仪器有限公司），分析天平（AB135-S，d=0.01/0.1 mg，Mettler-TeLedo），高效液相色谱仪（日本岛津，LC-2AT），色谱柱（Sepax HPLC18，4.6 mm250 mm 5 m）。1.2药材与试剂磷酸、乙腈均为色谱级；甲醇为分析级；迷迭香酸（批号 111871-201706，中国食品药品研究院），纯度98%；蒙花苷（批号 20210606，北京索莱宝科技有限公司），纯度98%。本次实验用的神香草药材产地主要为新疆各地区、州，由新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定，为正品硬尖神香草（Hyssopus officinalis）。2溶液的制备2.1对照品混合溶液的制备取迷迭香酸、蒙花苷对照品适量，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1毫升各含10 g的混合溶液，即得。2.2供试品溶液的制备取神香草粉末，精密称定0.5 g，于具塞锥形瓶中，精密吸取60%甲醇10 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率 500 W，频率 40 kHz）20 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。3色谱方法的建立色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸，按乙腈（A）0.1%磷酸（B）为（25 75）等度洗脱；流速为1.0 mL/min；柱温为30；进样体积为10 L；检测波长为330 nm。理论塔板数按迷迭香酸和蒙花苷计算均不得低于2 000，见图1。4样品处理方法4.1单因素试验由于迷迭香酸是一种水溶性物质，蒙花苷几乎不溶于水，二者极性差异较大，所以在实验过程中采用综合评分的方式评价迷迭香酸和蒙花苷提取效果，且神香草中迷迭香酸含量高于蒙花苷的含量，因此迷迭香酸权重系数占比高于蒙花苷的权重系数。综合评分=迷迭香酸含量/迷迭香酸最高含量0.6+蒙花苷含量/蒙花苷最高含量0.4。4.1.1提取方法的考察取神香草药材粉末（过筛）6份，分为两组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于具塞锥形瓶中，精密吸取25 mL甲醇，称重，每组分别采用加热回流和超声法提取（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 m微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，超声法提取效果最佳。结果见表1。4.1.2提取溶剂的考察取神香草药材粉末（过筛）24份，分为8组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于具塞锥形瓶中，每组分别精密吸取25 mL甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40%甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇，称重，超声法提取 30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 m微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取溶剂为60%甲醇时提取效果最佳。见表2。4.1.3提取溶剂的用量的考察取神香草药材粉末（过筛）12份，分为4组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于具塞锥形瓶中，每组分别按料液比 1 10、1 20、1 50、1 100精密吸取60%甲醇，超声法01050203040145155165175607013501050时间/min响应值/mAU2030401525354560705123456123456A AB BC C0525时间/min响应值/mAU1015201525354501234560525时间/min1015200525响应值/mAU1015205001000150020000025响应值/mAU15201505时间/min响应值/mAU1025355D D025时间/min响应值/mAU10152025354505响应值/mAU15白花前胡甲素白花前胡乙素白花前胡甲素白花前胡甲素白花前胡乙素白花前胡乙素白花前胡甲素白花前胡乙素注：1迷迭香酸；2蒙花苷。图1对照品及神香草样品330 nm高效液相色谱图：A为溶剂峰；B、C为对照品色谱峰；D为样品峰表1提取方法对测定结果的影响（n=3）提取方法超声加热迷迭香酸/%含量0.132 00.131 5RSD0.833 32.440 6蒙花苷/%含量0.064 10.036 2RSD1.777 21.878 9综合评分/分2.977 52.790 7252安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb，27（2）提取 30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过 0.22 m微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取溶剂的加入量为25 mL提取效果最佳。结果见表3。4.1.4超声处理时间的选择取神香草药材粉末（过筛）12份，分为4组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于锥形瓶中，精密吸取60%甲醇25 mL，采用超声法分别提取10、15、20、30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 m微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取时间为20 min提取效果最佳。结果见表4。4.1.5提取功率的考察取神香草药材粉末（过筛）12份，分为4组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于锥形瓶中，精密吸取60%甲醇25 mL，超声功率分别为150、250、350、500 W提取20 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 m微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取功率为350 W提取效果相对较好。结果见表5。4.1.6提取次数的选择取神香草药材粉末（过筛）9份，分为3组，每组平行操作3次，精密称定各0.5 g，于具塞锥形瓶中，精密吸取60%甲醇25 mL，采用超声法分别提取1、2、3次（20分/次），放冷，补足减失的重量，摇匀，过0.22 m微孔滤膜，取续滤液，以迷迭香酸、蒙花苷的综合评分作为指标进行比较。结果显示，提取2次时提取效率最高，为提取方法操作方便简单，故选择提取次数为2次。见表6。4.2提取工艺重复正交试验结合单因素试验的结果，以神香草中迷迭香酸和蒙花苷两种成分含量的综合评分作为考察指标，选择对迷迭香酸、蒙花苷提取效果影响较大的提取溶剂（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，每个因素选取3个水平，按照L9（34）正交表进行重复性正交试验，确定其最优提取工艺。神香草因素水平见表7，试验安排及结果见表8，方差分析结果见表9。各因素水平的变化对实验结果大小的影响可以通过各因素、水平的极差R值的大小直观反映，极差值越大影响越大，反之越小。因此由表8分析结果中可以直观看出四个因素对迷迭香酸和蒙花苷提取率影响的显著性依次是：BCAD，料液比在本次试验中是影响提取的最重要因素，其次是提取时间、提取溶剂，提取次数影响最小，最佳提取工艺为 A1B1C1D1，即提取溶剂 100%甲醇溶液、料液比 1 20、提取时间15 min、提取次数1次。从表9方差表2提取溶剂对测定结果的影响（n=3）提取溶剂甲醇80%甲醇60%甲醇40%甲醇95%乙醇80%乙醇60%乙醇40%乙醇迷迭香酸/%含量0.141 30.182 90.197 80.192 30.041 70.150 40.154 00.158 5RSD3.678 91.767 21.243 94.396 71.377 63.272 43.579 21.903 5蒙花苷/%含量0.068 80.024 60.018 00.006 20.010 10.027 60.028 10.015 5RSD1.190 93.367 33.893 92.056 42.469 62.233 81.346 73.020 5综合评分/分2.913 22.943 82.990 72.922 62.948 22.915 32.912 22.941 0表3料液比对测定结果的影响（n=3）料液比1 101 201 501 100迷迭香酸/%含量0.100 80.130 70.133 10.113 5RSD1.605 50.688 30.592 90.979 5蒙花苷/%含量0.033 20.047 90.064 00.061 2RSD2.975 75.627 73.430 23.695 6综合评分/分2.944 82.943 72.957 02.942 1表4提取时间对测定结果的影响（n=3）提取时间/min10152030迷迭香酸/%含量0.091 20.103 50.096 90.106 6RSD1.709 02.099 60.779 82.503 2蒙花苷/%含量0.050 10.054 80.053 90.056 4RSD2.915 43.175 32.770 52.349 3综合评分/分2.942 42.923 42.965 72.926 2表5提取功率对测定结果的影响（n=3）提取功率/W150250350500迷迭香酸/%含量0.085 40.096 50.098 10.100 2RSD1.996 11.509 41.362 41.040 4蒙花苷/%含量0.046 00.047 90.055 50.054 0RSD3.263 22.480 51.728 42.303 5综合评分/分2.933 82.943 52.972 32.951 1表6提取次数对测定结果的影响（n=3）提取次数/次123迷迭香酸/%含量0.093 10.116 00.118 2RSD1.245 52.070 62.024 4蒙花苷/%含量0.056 50.068 80.073 3RSD2.721 42.919 61.652 2综合评分/分2.961 03.024 83.018 9表7正交试验因素水平表水平123因素提取溶剂（A）100%甲醇80%甲醇60%甲醇料液比（B）1 201 501 100提取时间（C）15 min20 min30 min提取次数（D）1次2次3次253安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb，27（2）分析结果可知，因素B（料液比）、因素C（提取时间）差异有统计学意义（P0.050.050.05表10验证试验结果/%编号123迷迭香酸含量0.180 50.176 60.176 0平均含量0.177 7RSD1.386 5蒙花苷含量0.029 80.030 20.029 5平均含量0.029 8RSD1.307 0254