一种新型拟除虫菊酯类农药半抗原的设计合成及其效果评价_杨星星.pdf

一种新型拟除虫菊酯类农药半抗原的设计合成及其效果评价杨星星1，付 辉1*，王炳志1，李细清1，张 鑫1，严义勇1，王幸幸2(1深圳市易瑞生物技术股份有限公司，广东深圳 518101;2深圳市通量检测科技有限公司，广东深圳 518038)摘要基于菊酯类农药特殊结构及现有合成菊酯半抗原的种种问题，设计一种新型合成拟除虫菊酯半抗原方法。该方法以菊酯类原药为原料，经臭氧氧化、卤代反应、维悌希反应、水解 4 步化学反应合成半抗原。采用该方法合成了氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯半抗原，这些半抗原分别与牛血清蛋白和卵清蛋白偶联，获得免疫抗原和包被抗原。用这 4 种免疫抗原分别免疫 BALB/C 小鼠，制备多克隆抗血清。采用免疫分析方法对这 4 种多克隆抗血清的性能进行测试，该抗血清的效价都较高，达到 15 000 倍以上;用 1 mg/L 拟除虫菊酯原药进行竞争试验，除溴氰菊酯外其余抑制率均可达到 50%以上。说明设计的半抗原结构和合成方法可行，为后续进一步研究提供参考。关键词拟除虫菊酯类农药;半抗原;合成;免疫分析中图分类号TS2073文献标识码A文章编号05176611(2023)01018804doi:103969/jissn05176611202301042开放科学(资源服务)标识码(OSID):Design and Synthesis of a New Pyrethroid Pesticide Hapten and Its Effect EvaluationYANG Xing-xing，FU Hui，WANG Bing-zhi et al(Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co，Ltd，Shenzhen，Guangdong 518101)AbstractBased on the special structure of pyrethroid pesticides and various problems in the synthesis of pyrethroid hapten，a new method forthe synthesis of pyrethroid hapten was designed The haptens were synthesized by using pyrethroids as raw materials through four chemical reac-tions:ozone oxidation，halogenation，wittig reaction and hydrolysis Using this method，we synthesized cypermethrin，cypermethrin，cyhalo-thrin and deltamethrin haptens These haptens were coupled with bovine serum protein and ovalbumin to obtain immune antigens and coatingantigens BALB/c mice were immunized with these four immune antigens to prepare polyclonal antiserum The performance of the four poly-clonal antisera were tested by immunoassay The titers of the antisera were high，up to more than 15 000 In the competitive test with 1 mg/Lpyrethroid，the inhibition rates were more than 50%except deltamethrinIt was indicating that the designed haptens structure and synthesismethods were feasible，which provided a reference for further researchKey wordsPyrethroid pesticide;Hapten;Synthesis;Immunoassay基金项目广东省科技厅项目(2021A0505080003);国家重点研发计划项目(2019YFC1605500);上海市科技兴农项目(201902080015F01147)。作者简介杨星星(1985)，男，湖北随州人，高级工程师，硕士，从事食品安全快速检测研究。*通信作者，高级工程师，从事食品安全快速检测研究。收稿日期20220212;修回日期20220324拟除虫菊酯类农药由于其高效低毒被广泛用于蔬菜、水果、农作物、林业的害虫防治。然而，随着拟除虫菊酯类农药长期大量的使用，其原药本体及代谢物残留危害日益明显，现已引起世界各国研究者的极大关注12。目前，检测拟除虫菊酯残留最常用的方法是气相色谱法，此外，高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱色谱联用技术等311 也都可用于拟除虫菊酯残留的检测，但这些仪器分析法对样品基质要求高，往往需要复杂的前处理，不仅耗时费钱，而且会造成痕量拟除虫菊酯的损失;再加上这些仪器分析方法无法满足低成本、高通量、快速检测和现场检测的要求。免疫分析法由于前处理简单、使用方便等优点正好可以弥补这些不足，因此建立拟除虫菊酯的免疫检测技术具有很好的发展前景和市场潜力。建立拟除虫菊酯免疫检测方法的关键是制备亲和力强和高灵敏度的抗体，而重点在于半抗原的设计合成。一直以来，由于对抗原抗体作用机理以及半抗原空间结构的了解不足，导致半抗原设计具有很大的盲目性，通常需要反复多次的试错尝试，耗费了大量的资金和时间。而且对于非有机合成专业的人员来说，对目标物进行有机修饰或从头合成半抗原，往往非常困难。另外，拟除虫菊酯是一类典型的手性农药，含有多个旋光异构单体，这对于能够识别手性单体的抗体而言，一种菊酯往往是多种物质的混合物，增大了免疫分析的难度。目前针对拟除虫菊酯半抗原的合成主要有全合成在苯环上衍生手臂1214、在菊酯的氰基上衍生手臂，这些方法制备的半抗原手性结构会有很多种，而对半抗原进行手性分离又是非常困难的事;有的甚至只使用菊酯的部分结构1516，导致免疫获得的抗血清竞争不理想。为了能够有效地获得高质量拟除虫菊酯的抗体，笔者经过多次尝试成功运用拟除虫菊酯原药为原料，在不改变菊酯整体结构情况下，经过几步简单的合成，制备出与原药手性结构一样的农药半抗原单体;并对几种拟除虫菊酯的抗血清进行性能测试，能够满足一定的要求，为后续进一步研究提供参考。1材料与方法11试验材料111主要试剂。氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯原药购自成都温江试剂;二甲硫醚、三苯基磷乙酸叔丁酯、无水四氢呋喃、三氟乙酸、N，N二甲基甲酰胺(DMF)、1乙基(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N羟基琥珀酰亚胺(NHS)、液 溴 购 于 上 海 安 耐 吉 试 剂 公 司;卵 清 蛋 白(Ovalbumin，OVA)、牛 血 清 蛋 白(Bovine serum albumin，BSA)、弗氏佐剂购自美国 Sigma 公司;羊抗小鼠 IgGHP 购自北京Solarbio生物有限公司;拟除虫菊酯类农药标准品购自北京坛墨质检;包被液、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB 底物溶液、终止液均参考文献 17 配制。安徽农业科学，JAnhui AgricSci 2023，51(1):188191112实验动物。Balb/c 小鼠，雌性，89 周龄，体重 2022g(广东省医学动物实验中心)。113仪器。DHJF8002 低温恒温搅拌反应浴(郑州长城科工贸有限公司);旋转蒸发仪(日本爱朗公司);酶标板自动洗涤机(美国，Biotech);API 3000 液质联用仪(美国，AB);酶标仪(美国，Thermo);臭氧发生器(广州奥普发环保科技有限公司)。12试验方法121半抗原的合成。称取 10 mmol 拟除虫菊酯原药(氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯)，用 30 mL 二氯甲烷溶解后转移至冷阱中，在78 下通入预干燥并预冷却的臭氧6 h(臭氧通过臭氧发生器制备，产气量为 20 g/h)。反应完成后通入预干燥并预冷却的氮气 15 min，再加入 70 mmol 二甲硫醚，78 通入氮气鼓泡反应 30 min 后取出，蒸干溶剂，过柱纯化得无色油状物 JZ1。将 12 mmol 三苯基磷乙酸叔丁酯溶于 30 mL 二氯甲烷，在冰水浴下通入氯气直到体系变黄绿，停止氯气(注:若是制备溴氰菊酯半抗原则是直接加入液溴)，继续搅拌过夜，反应完成后旋干后无需后处理直接用，即得到 JZ2。取 40 mmol JZ1 再加入 60 mmol JZ2，用无水四氢呋喃 20 mL 与二氯甲烷 3 mL 溶解。室温搅拌反应 4 h，反应完成后加适量水用乙酸乙酯萃取 23 遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化，得到无色油状物 JZ3。称取 15 mmol JZ3 溶于 6 mL 二氯甲烷，再加入 3 mL三氟乙酸，室温搅拌反应 1 h，反应完成后旋蒸除去溶剂，加乙酸乙酯 30 mL，用柠檬酸柠檬酸钠饱和溶液洗涤 2 次，再用水洗涤 2 次，最后用饱和食盐水洗涤 1 次，有机相干燥后旋干，得白色固体即菊酯半抗原，分别编号为 JZH1、JZH2、JZH3、JZH4，具体合成路线和结构见图 1 和表 1。注:1、2为 H、Cl、Br、F3C;为菊酯其他带有苯环结构;X 为Cl、Br。Note:1and 2are H，Cl，Br and F3C-;is pyrethroid and othershave benzene ring structure;X is Cl，Br图 1拟除虫菊酯半抗原合成路线Fig1Synthesis route of pyrethroid hapten表 14 种拟除虫菊酯半抗原结构Table 1The structure of four pyrethroid haptens化合物Compound半抗原结构和编号Hapten structure No分子量MolecularweightDa氯氰菊酯CypermethrinJZH142510氯菊酯PermethrinJZH240011氯氟氰菊酯CyhalothrinJZH344309溴氰菊酯DeltamethrinJZH446905122人工抗原的合成。采用活泼酯法将合成的拟除虫菊酯半抗原 JZH1、JZH2、JZH3、JZH4 分别与载体蛋白 BSA相偶联，制备菊酯人工免疫抗原。具体步骤:称取 1 mmol 半抗原、11 mmol N羟基琥珀酰亚胺、12 mmol 1乙基(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，加入 05 mL DMF 溶解，在磁力搅拌下室内温度进行反应 8 h。反应结束后吸取02 mL，缓慢滴加到 3 mL 10 mg/mL 的 BSA 碳酸盐缓冲液(pH 96)/DMF(21，v/v)混合液中，在磁力搅拌下室温反应6 h。将反应液置于透析袋内，在 001 mol/L pH 74 的 PBS溶液中搅拌透析，每 48 h 换 1 次透析液，共透析 72 h。透析结束后将透析袋中的蛋白溶液分成若干等份分装于 1 mL离心管中，分别编号 JZH1BSA、JZH2BSA、JZH3BSA、JZH4BSA，于20 冰箱中存放备用。采用混合酸酐法制备包被原，具体步骤:将 1 mmol 菊酯半抗原溶于 05 mL DMF，冰浴下，加入 12 mmol 三丁胺、12 mmol氯甲酸异丁酯，室温避光搅拌反应 60 min，得到的混合酸酐溶 液 缓 慢 滴 加 到 3 mL 20 mg/mL 的 OVA PBS(001 mol/L，pH 74)/DMF(21，v/v)混合液中，室温磁力搅拌反应 3 h，将反应液置于透析袋内，在 001 mol/L pH 74 的PBS 溶液中搅拌透析，每 48 h 换 1 次透析液，共透析72 h。透析结束后将透析袋中的蛋白溶液分成若干等份分装于 1mL 离心管中，分别编号 JZH1OVA、JZH2OVA、JZH3OVA、JZH4OVA，于20 冰箱中存放备用。123抗血清制备。选取12 只8 周龄的 Balb/c 雌性小鼠分为 4 组，每组(编号分别为 1 号、2 号、3 号小鼠)首先是尾部采血取血清作为阴性血清，之后进行免疫，免疫 4 次，每次免疫间隔 21 d，第 4 次免疫后 7 d，挖眼采集血清 100 L，冰箱过夜，10 000 r/min 离心 10 min，得到菊酯鼠多抗血清。124抗血清效价和灵敏度测定。将包被原 JZH1OVA、JZH2OVA、JZH3OVA、JZH4OVA 用碳酸缓冲液稀释至所需浓度包被后，抗血清效价的测定采用间接非竞争ELISA 操作程序，抗血清灵敏度的测定采用间接竞争 ELISA98151 卷 1 期杨星星等一种新型拟除虫菊酯类农药半抗原的设计合成及其效果评价操作程序，具体程序参照文献 18。2结果与分析21半抗原的鉴定将“121”合成的 4 种拟除虫菊酯半抗原 JZH1、JZH2、JZH3、JZH4 采用质谱进行测定，检测在负离子模式下进行，如图 2 所示。从图 2 可以看出，这些半抗原均可得到分子离子峰 MH以及倍峰 2MH;JZH1 分子离子峰 4244 MH，倍峰 8495 2MH;JZH2分子离子峰 3994 MH，倍峰 7997 2MH;JZH3 分子离子峰 4426 MH，倍峰 8855 2MH;JZH4 分子离子峰 4706 MH，倍峰 9396 2MH;这些峰均与其对应化合物的分子量相符(表 1)，说明这些半抗原合成成功。图 24 种拟除虫菊酯半抗原质谱图Fig2The MS of four pyrethroid haptens22人工抗原的鉴定将菊酯半抗原分别与载体蛋白偶联后，制备获得包被抗原和免疫抗原，通过紫外扫描获得相应的紫外吸收光谱(图 3)。从图 3 可以看出，偶联物的紫外吸收均发生明显变化，表明半抗原与载体蛋白偶联成功。图 3免疫抗原和包被抗原紫外吸收光谱Fig3UV absorption spectrum of immune antigen and coating antigen091安徽农业科学2023 年23抗血清效价和灵敏度测定由间接非竞争 ELISA 法测定 4 种药物产生的抗血清，经过 4 次免疫，抗血清的效价均达到 15 000 倍以上(表 2)，说明被免疫的小鼠产生了抗体。表 2各小鼠免疫效价Table 2Immune titers of mice化合物Compound小鼠编号Mice No效价Titer倍包被抗原Coating antigen氯氰菊酯115 000JZH1OVACypermethrin216 000320 000氯菊酯125 000JZH2OVAPermethrin218 000315 000氯氟氰菊酯120 000JZH3OVACyhalothrin225 000320 000溴氰菊酯125 000JZH4OVADeltamethrin220 000330 000在这 4 类药物抗血清中，每种选择效价较高的小鼠抗血清利用竞争 ELISA 法进行抗体灵敏度检测。以 02 mg/mL浓度的 JZH1OVA、JZH2OVA、JZH3OVA、JZH4OVA 包被原分别包被酶标板，分别配制 0、0000 1、0001 0、0100 0、1000 0、10000 0、100000 0 mg/L 7 个梯度的菊酯标准溶液(含 10%甲醇，pH 72)。每孔依次加入 50 L 待测菊酯标准溶液、50 L 抗血清(氯氰菊酯稀释20 000倍、氯菊酯稀释25 000倍、氟氯氰菊酯稀释25 000倍、溴氰菊酯稀释30 000倍)。间接竞争 ELISA 法的抑制曲线如图 4 所示。从图 4 可以看出，4 种抗血清均有竞争，随着各菊酯标准品用量的增加，抑制率会逐渐升高;在 1 mg/L 时除了溴氰菊酯的抑制率低于 50%，其余均高于 50%，这说明血清中的抗体和各菊酯发生了特异性结合反应，抗血清中存在针对菊酯的特异性抗体，直接证明了制备的各菊酯人工抗原合成成功。图 4各菊酯的抑制曲线Fig4Inhibition curve of each pyrethroid3讨论有关拟除虫菊酯类农药的免疫检测已经有很多学者进行了报道，菊酯类农药免疫检测的一大难点就是设计合成其半抗原，现有研究一般采用全合成的方法进行制备，而由此带来的问题是合成的半抗原会有很多手性结构，导致免疫结果不理想，制备的抗体往往有滴度而没有竞争。该研究首次以 4 种拟除虫菊酯为事例，采用原药经臭氧氧化、氯代反应、维悌希反应、水解 4 步化学反应合成半抗原，没有改变药物的手性结构，最大限度地保留药物本身的官能团，这样制备的抗体才能有较高的灵敏度和特异性。参考文献 1 HAYA KToxicity of pyrethroid insecticides to fishJ Environ ToxicolChem，1989，8(5):381391 2 王鸣华拟除虫菊酯化学 M 北京:中国农业科学技术出版社，2004:122 3 OSS M K，BOAZJANI A，EDWADS C C，et alHydrolytic metabolismof pyrethroids by human and other mammalian carboxylesterases J Bio-chem Pharmacol，2006，71(5):657669 4 ISSATO S，GALHIANE M S，APON B M，et alMultiresidue analysisof pesticides in soil by supercritical fluid extraction/gas chromatographywith electron-capture detection and confirmation by gas chromatography-mass spectrometry J J Agric Food Chem，2005，53(1):6269 5 BISSACOT D Z，VASSILIEFF IHPLC determination of flumethrin，delta-methrin，cypermethrin，and cyhalothrin residues in the milk and blood oflactating dairy cows J J Anal Toxicol，1997，21(5):397402 6 ESTEVE-TUILLAS F A，PASTO A，DE LA GUADIA MDetermina-tion of pyrethroid insecticide residues in vegetable oils by using combinedsolid-phases extraction and tandem mass spectrometry detection J AnalChimica Acta，2005，553(1/2):5057 7 LI H P，LIN C H，JEN J FAnalysis of aqueous pyrethroid residuals by one-step microwave-assisted headspace solid-phase microextraction and gaschromatography with electron capture detection J Talanta，2009，79(2):466471 8 NIEWIADOWSKA A，KILJANEK T，SEMENIUK S，et alDetermination ofpyrethroid residues in meat by gas chromatography with electron capturedetection J Bull Vet Inst Pulawy，2010，54(4):595599 9 ANGEE J，ITTE ADetermination of metabolites of pyrethroids in hu-man urine using solid-phase extraction and gas chromatography-mass spec-trometry J J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1997，695(2):217226 10 FENANDEZ-ALVAEZ M，LLOMPAT M，LAMAS J P，et alDevelop-ment of a solid-phase microextraction gas chromatography with microelec-tron-capture detection method for a multiresidue analysis of pesticides inbovine milk J Anal Chim Acta，2008，617(1/2):3750 11 吴俐，曹赵云，陈铭学，等气相色谱串联质谱测定水稻中 10 种拟除虫菊酯类杀虫剂农药残留 J 安徽农业科学，2017，45(6):147150 12 孔晔，李培武，张奇，等一种新型溴氰菊酯农药半抗原的合成及应用效果 J 化学试剂，2009，31(4):245249 13 QUEFFELEC A L，NODET P，HAELTES J P，et alHapten synthesis fora monoclonal antibody based ELISA for deltamethrinJ J Agric FoodChem，1998，46(4):16701676 14 LEE N，MCADAM D P，SKEITT J HDevelopment of immunoassays fortype II synthetic pyrethroids1Hapten design and application to heterolo-gous and homologous assays J J Agric Food Chem，1998，46(2):520534 15 魏新林，刘莹，张少恩，等氰戊菊酯特异性人工抗原的合成与鉴定 J 农产品加工，2009(3):59 16 WATANABE T，SHAN G M，STOUTAMIE D W，et alDevelopment of aclass-specific immunoassay for the type I pyrethroid insecticides J AnalChimica Acta，2001，444(1):119129 17 朱立平，陈学清免疫学常用实验方法 M 北京:人民军医出版社，2000:351357 18 李波，施海燕，王鸣华氯氟氰菊酯及其代谢物的人工抗原合成与多克隆抗体的制备 J 农药学学报，2007，9(4):41541819151 卷 1 期杨星星等一种新型拟除虫菊酯类农药半抗原的设计合成及其效果评价