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第 33 卷第 1 期广东石油化工学院学报Vol 33No 12023 年 2 月Journal of Guangdong University of Petrochemical TechnologyFebruary 2023一种新型芘衍生物荧光探针高选择性检测半胱氨酸李鑫，黄小珊，沈子悦，孙明泰(广东石油化工学院 环境科学与工程学院，广东 茂名 525000)摘要:半胱氨酸(Cys)作为一种重要的生物硫醇，与多种疾病的发生发展密切相关。因此，设计一种高选择性、高灵敏度的快速识别 Cys 的探针具有重要意义。文章以 1，6 芘二酮与乙二胺衍生物为原料，通过 Michael 加成反应，合成了一种未经报道的含酚氧杂芘荧光染料。该母体通过取代反应合成了一种丙烯酸酯为识别基团的荧光探针(PY 1)。探针分子 PY 1 与半胱氨酸发生分子内环化反应后荧光恢复，从而构建了一种荧光“关开”式特异性识别 Cys 的传感器，检出限为 0 6mol/L。同时探针 PY 1 能高选择性地识别 Cys 而不受结构相似的谷胱甘肽(GSH)和高半胱氨酸(Hcy)等物质的影响。结果表明探针分子具有很好的选择性和较高的灵敏度。关键词:半胱氨酸;荧光探针;芘;荧光检测;可视化中图分类号:X13文献标识码:A文章编号:2095 2562(2023)01 0024 04半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)和高半胱氨酸(Hcy)是体内最常见的生物硫醇，这些含硫氨基酸在生理和病理过程中有着重要作用，其中半胱氨酸(Cys)是一种参与蛋白质合成、解毒和代谢的必需氨基酸1 3。这些巯基的内源浓度恰当地反映了相应的酶和蛋白质的功能状态，它们的异常水平与疾病有关。含硫酶和蛋白质的浓度可通过检测体内生物巯基间接监测，该方法具有很大的临床应用价值诊断。因此，发展高度准确，选择性检测硫醇的简便方法很重要。近年来，各种方法(包括高效液相色谱法4，5、质谱法6，7、毛细管电泳8 和电化学方法9，10)已被提出用于检测生物硫醇的浓度用于研究其与生物健康的关系。然而，传统方法有不可避免的缺点，如检测成本高、检测时间长，预处理复杂，体内应用有限等。近年来，荧光探针作为最有效的分子工具，由于其简单、灵敏、实时成像和无损检测的特点，可实现生物系统中的微量靶向生物分子的可视化检测。至今，已开发了各种荧光探针来检测生物硫醇11，12。本文中作者设计了以丙烯酸酯为识别基团的荧光探针用于 Cys 的高灵敏选择性检测。为了提高对Cys 的检测特异性，我们设计并合成了一种新型的触发式荧光探针 PY 1。我们以芘为原料，通过氧化，Michael 加成等反应，合成了一种未经报道的含酚氧杂芘染料，这种酚染料的结构类似于荧光素，酚羟基的取代反应会使分子的荧光发生改变，从而得到一种无背景荧光的分子探针。该探针的荧光可以被 Cys 选择性地打开，荧光增强效果明显，灵敏度高。1实验部分1 1试剂与仪器试剂:芘，重铬酸钠，乙二胺，三乙胺，2 醛基吡啶，均为分析纯，购自 Sigma Aldrich(默克中国)。采用 F254 硅胶板进行薄层色谱(TLC)分析。L 半胱氨酸(98%)，L 谷胱甘肽(还原型，98%)和 DL 高半胱氨酸均为分析纯，购自国药集团。所用水均为超纯水。收稿日期:2022 04 02;修回日期:2022 05 06基金项目:国家自然科学基金项目(22176044);广东省普通高校重点领域专项(2021ZDZX4014);广东石油化工学院科研基金项目(2019rc057)作者简介:李鑫(1992)，女，河北保定人，硕士，研究方向为生物信息学。通信作者:孙明泰(1984)，男，山东聊城人，博士，副研究员，主要从事环境污染物检测研究。仪器:UV 1601 紫外可见分光光度计(日本岛津);Horiba FluoroMax 4 高灵敏一体式荧光光谱仪(美国新泽西)，配备有绘图单元和石英池(1cm 1 cm);500 MHz 核磁共振仪(德国布鲁克);MAT 高分辨质谱仪(Finnigan 公司);Millipore 实验室超纯水系统(美国波士顿)。1 2探针制备探针的合成路线如图 1 所示。新型荧光分子化合物 1 的制备合成:1，6 芘二酮的制备参考文献方法合成13。探针 PY 1 的制备合成:在氮气保护下，向带有搅拌子的 100 mL 单口烧瓶中加入 45 mg化合物 1(0 095 mmol)，然后加入 20 mL 干燥的二氯甲烷，加入三乙胺 100 mL，混合物搅拌溶解。在冰图 1荧光探针 PY 1 合成流程浴条件下，向上述溶液中通过注射器滴加丙烯酰氯 10 L(1 3 eq)，1min 内滴完。得到的溶液缓慢升至室温，继续搅拌 4 h。反应液加入 10 mL 的去离子水淬灭反应，加入二氯甲烷萃取分液，有机相依次用NaHCO3水溶液和饱和食盐水洗涤，合并得到的有机相用无水硫酸钠干燥。旋转蒸发溶剂，得到的粗产物以乙酸乙酯/正己烷为流动相进行柱层析分离提纯，得到最终产物 PY 1 42 mg，产率84%。1H NM(500MHz，CD2Cl2)8 79(d，J=4 9 Hz，1H)，8 70(d，J=4 5 Hz，1H)，8 57(s，1H)，8 47(s，1H)，8 10(t，J=7 8 Hz，2H)，8 04(d，J=9 1 Hz，1H)，7 95(d，J=9 2 Hz，1H)，7 88 7 77(m，1H)，7 70(dd，J=19 5，8 1 Hz，2H)，7 60(d，J=8 3 Hz，1H)，7 41 7 33(m，1H)，6 85 674(m，1H)，6 59(dd，J=17 3，10 4 Hz，2H)，6 25(s，1H)，6 19(dd，J=10 5，1 1 Hz，1H)，5 05(d，J=18 4 Hz，1H)，4 88(d，J=18 7 Hz，1H)，3 54(s，2H)，3 42(s，2H)ESI MS:m/z C33H24N4O3 M+H+:525 17。1 3光谱测试探针储备液的配制(1mmol/L):称取 2 62 mg 的 PY 1 放在 10 mL 的圆底烧瓶中，用移液器量取 5mL 无水乙醇，搅拌溶解得到储备液，放于冰箱中冷藏备用。半胱氨酸储备液的配制(10 mmol/L):称取363 mg 的化合物放在 5 mL 离心管，用移液器取 3 mL 超纯水，剧烈晃动使之溶解得到 Cys 储备液。同样方法配制 Hcy、GSH 储备液。探针测试溶液的配制:取4 L 探针储备液加入1996 L 的 PBS 7 4 的缓冲溶液中，混合均匀，然后扫描紫外 可见吸收光谱和荧光光谱。荧光分光光度计的参数设置如下:激发波长为 400 nm;发射光谱扫描范围 425 650 nm;激发和发射光的狭缝宽度均为 5 nm。2结果与讨论2 1荧光探针的合成和光谱性能以 1，6 芘二酮和乙二胺衍生物为原料，乙腈为溶剂，二者通过 Michael 加成反应在室温下过夜反应就可以以较高的产率一步法合成得到荧光分子 1。化合物 1 的核磁氢谱显示，CH 的化学位移在 3055 Hz、OCH2的位移在 2880 Hz 处，而 N(CH2)2N 由于不对称结构，化学位移在 2200 Hz 和 1665 Hz 分别有两个dd 峰。酚羟基的峰位于 5110 Hz。荧光分子 1 在 380 nm 和 400 nm 处有两个主要的宽吸收峰，其荧光发射最大波长位于 530 nm 处，展现出较宽的斯托克位移(Stokes shift=130 nm)，在紫外灯下可观察到强的绿色荧光。以溶解在0 1 mol/L 的 NaOH 溶液中的荧光素(量子产率 F=95%)作为标准参考物，计算荧光分子 1 的荧光量子效率为 F=17 8%。化合物 1 与丙烯酰氯在二氯甲烷中反应，三乙胺为缚酸剂，得到目标荧光探针分子 PY 1。该反应简单，条件温和，产率可达到 84%，通过核磁氢谱分析对分离提纯后的探针分子进行了表征。2 2稳定性与响应时间首先对探针的稳定性进行了考察。如图 2 所示，用 410 nm 的激发光照射探针的 PBS 缓冲溶液，并扫52第 1 期李鑫等:一种新型芘衍生物荧光探针高选择性检测半胱氨酸描发射光谱，每隔 2 min 扫描一次，可以发现 30 min 内探针的最大发射波长的强度没有明显的变化，显示探针具有较好的光稳定性。为确定探针 PY 1 与 Cys的最佳反应时间，进一步探究了探针与 Cys 的响应时间，如图 3所示，在 7 min 之后反应达到平衡状态。2 3Cys 检测图 2荧光探针 PY 1 光稳定性图 3探针 PY 1 与 Cys 的荧光响应动力学我们用荧光光谱法研究了探针对半胱氨酸的响应。图4 所示的是探针 PY 1 溶于 PBS 7 4 缓冲溶液中，加入 Cys 后随时间变化的荧光光谱。PY 1 在 PBS(50 mol/L，pH 值 7 4)中具有良好的溶解度，其背景荧光强度十分微弱或无荧光。向该体系中加入半胱氨酸后，其荧光强度逐渐增强，探针溶液变为亮绿色荧光，并且具有相对较好的线性响应(见图5)。根据三倍空白信号偏差所得拟合曲线，计算出探针分子对图 4探针 PY 1 加入不同浓度的荧光光谱图 5探针 PY 1 与 Cys 的线性响应Cys 的检出限为 0 6 mol/L。测试条件:半胱氨酸浓度:0，2，4，6，8，10，12，14，16 mol/L。加入半胱氨酸后反应 8 min，激发波长 410 nm，发射波长范围 425 700 nm。2 4选择性为了研究探针分子 PY 1 对半胱氨酸检测的选择性，我们测定了探针对其他不同活性物质的荧光响应，包括一些常见的重金属离子，活性氧如过氧化氢(H2O2)，次氯酸，亚硝酸根(NO2)，和硫化氢(H2S)，以及其他的生物硫醇如谷胱甘肽，高半胱氨酸等。结果显示，只有半胱氨酸可以在较低的浓度下快速地打开探针 PY 1 的荧光。谷胱甘肽和高半胱氨酸也可在较高的浓度下打开探针的荧光，但图 6荧光探针 PY 1 对不同物质种类的选择性是反应速率很慢，如图 6 所示。当其他活性物质或者重金属离子存在时，PY 1 探针溶液的荧光几乎未发生变化，说明该探针对检测半胱氨酸具有很高的选择性。2 5机理探讨基于以上实验现象和结果，我们提出了荧光探针 PY 1 对 Cys 检测的一种可能的响应机制。当探针与半胱氨酸(Cys)反应时发生了分子内环化反应，形成一个七元环，而在与 Hcy 反应时，形成一个八元环，在动力学上其形成难易程度要比七元环的形成弱得多。因此，探针与半胱氨酸的反应速度比 Hcy 快得多。对于 GSH 和 H2S，在 Michael 加成反应后，分子内几乎不可能环化。因此，PY 1 探针可以在 H2S、Hcy 存在时特异性地检测 Cys。基于分子内电荷转移机理，在探针 PY 1 和 Cys 分子发生亲核加成反应后，酯键断裂，荧光团化合物 1 从反应体系中分离出来(见图 7)，形成一个新的荧光发射体系，从而实现荧光增强检测 Cys。62广东石油化工学院学报2023 年2 6便携式 Cys 指示瓶可视化传感器件和装备由于快速便携受到广泛的研究，因此设计一种荧光可视化指示瓶可极大提高 Cys 的定性及半定量检测效率。利用荧光探针PY 1 和 Cys 的反应特性，我们探索了探针分子可视化检测 Cys 的应用潜力。先将 2 mL 的浓度为 1mmol/L 的探针储备液加入离心管中，再向离心管中加入 4 L 浓度为 0，1，5，10，15，20 mmol/L 的 Cys溶液。结果显示，指示瓶内荧光强度逐渐增强，探针图 7荧光探针与 Cys 的响应机理溶液变为亮绿色荧光，实现了半定量现场可视化检测 Cys(见图 8)。3结论本文设计合成了一种新型的未经报道的基于含酚氧杂芘染料的荧光探针。探针对 Cys 展现出良好的荧光增强响应，实现了对 Cys 的灵敏性检测。探针有机合成反应条件温和，产率较高，具有潜在产业图 8荧光探针指示瓶可视化传感检测 Cys化生产应用能力。最后将探针制成简易的定性及半定量指示瓶用于 Cys 的快速便捷可视化检测。参考文献 1YIN G，NIU T，GAN Y A multi signal fluorescent probe with multiple binding sites for simultaneous sensing of cysteine，homocysteine，and glutathione J Angewandte Chemie，2018(18):5085 5088 2王胜清，申世立，张延如 小分子生物硫醇荧光探针研究进展 J 有机化学，2014(9):1717 1729 3马亚光，张玉涛，马一宇 基于菁染料高选择性检测半胱氨酸的近红外荧光探针 J 影像科学与光化学，2018，36(3):236 244 4KUMIEEK K，GtOWACKI，BALD E Analysis of urine for cysteine，cysteinylglycine，and homocysteine by high per-formance liquid chromatography J Analytical and bioanalytical chemistry，2006(5):855 860 5CHWATKO G，BALD E Determination of cysteine in human plasma by high performance liquid chromatography and ultravioletdetection after pre column derivatization with 2 chloro 1 methylpyridinium iodide J Talanta，2000(3):509 515 6FOGACSOVA A，GALBA J，MOJZISOVA J Ultra high performance hydrophilic interaction liquid chromatography triplequadrupole tandem mass spectrometry method for determination of cysteine，homocysteine，cysteinyl glycine and glutathionein rat plasma J Journal of pharmaceutical and biomedical analysis，2019，164:442 451 7GACA SANTAMAINA S，BOONAT S，DOMNECH A Monitoring in vivo reversible cysteine oxidation in proteins u-sing ICAT and mass spectrometry J Nature protocols，2014(5):1131 1145 8IVANOV A V，VIUS E D，LUZYANIN B P Capillary electrophoresis coupled with 1，1 thiocarbonyldiimidazole derivatiza-tion for the rapid detection of total homocysteine and cysteine in human plasma J Journal of Chromatography B，2015，1004:30 36 9LEE P T，THOMSON J E，KAINA A Selective electrochemical determination of cysteine with a cyclotricatechylene modifiedcarbon electrode J Analyst，2015(1):236 242 10NEZAMZADEH EJHIEH A，HASHEMI H S Voltammetric determination of cysteine using carbon paste electrode modifiedwith Co(II)Y zeolite J Talanta，2012，88:201 208 11YANG X，GUO Y，STONGIN M Conjugate addition/cyclization sequence enables selective and simultaneous fluores-cence detection of cysteine and homocysteine J Angewandte Chemie，2011(45):10878 10881 12刘学文，唐裕才 一种钌()配合物荧光探针用于半胱氨酸和高半胱氨酸的检测 J 应用化学，2019(12):1456(下转第 37 页)72第 1 期李鑫等:一种新型芘衍生物荧光探针高选择性检测半胱氨酸ble and active electrocatalyst for methanol oxidation reaction J Journal of Electroanalytical Chemistry，2020:113739 10ODIGUEZ J，FUENTES MOYADO S，ZEPEDA T，et al Methanol electro oxidation with alloynanoparticles of Pt10 x Fex supported on CNTs J Fuel，2016:1 7 11CAI Z，KAMIKO M，YAMADA I，et al PtCo3Nanoparticle Encapsulated Carbon Nanotubes as ActiveCatalysts for MethanolFuel Cell Anodes J ACS Applied Nano Materials，2021(2):1445 1454Preparation and Electrochemical Performance of Pt/Ni Co/CNTs CatalystLUO Lanping1，HE Yuchao2，LI Xiang2(1 Analysis and Testing Center，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，China;2 College of Chemical Engineering，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，China)Abstract:Pt/CNTs catalyst is modified by co doping with Ni and Co ions Firstly，Ni Co/CNTs are prepared by liquid impreg-nation method，and the results of X ray diffraction and Energy Dispersive X ay Spectroscopy are used to judge whether Ni Co/CNTs are successfully prepared Then the amount of Ni Co is optimized by the activity of electro catalytic methanol oxidation re-action，and the electrochemical activity and stability of doped Pt/Ni Co/CNTs and non doped Pt/CNTs are compared esultsshow that the optimal amount of Ni Co is 30%，and the modified Pt/Ni Co/CNTs show higher electro catalytic activity and betterstability This study has a certain guiding role in Pt/CNTs catalyst modification，reducing the cost and improving the catalyst poison-ing of methanol fuel cell anode catalystKey words:direct methanol fuel cell(DMFC);methanol oxidation reaction;electro chemical characterization;catalyst;co do-ping(责任编辑:余雪芳)(上接第 27 页)13YASUTAKE M，FUJIHAA T，NAGASAWA A，et al Hirose T Synthesis and Phase Structures of Novel Acceptor DiscoticLiquid Crystalline Compounds Having a Pyrenedione Core J European Journal of Organic Chemistry，2008，24:4120 4125A Novel Pyrene Derivative Based Fluorescent Probe for HighlySelective Detection of CysteineLI Xin，HUANG Xiaoshan，SHEN Ziyue，SUN Mingtai(Guangdong Provincial Key Laboratory of Petrochemical Pollution Process and Control，College of EnvironmentalScience and Engineering，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，China)Abstract:Cysteine(Cys)，an important biothiol，is closely related to the occurrence and development of a variety of diseasesTherefore，it is of great significance to design a probe with high selectivity and sensitivity for rapid recognition of Cys An unreportedfluorescent dye containing phenoxypyrene is synthesized from 1，6 pyrene dione and ethylenediamine derivatives by Michael addi-tion reaction The fluorescent probe(PY 1)with acrylate as recognition group is synthesized by substitution reaction The fluores-cence of probe PY 1 is recovered after intramolecyclization with cysteine，and a fluorescence off onsensor is constructed for Cyssensitive detection The limit of detection is determined as 0 6 mol/L Meanwhile，the probe PY 1 can selectively recognize Cyswithout being affected by the similar structures of glutathione(GSH)and homocysteine(Hcy)The results show that the probe hasgood selectivity and high sensitivity toward CysKey words:cysteine;fluorescent probe;pyrene;fluorescence detection;visualization(责任编辑:余雪芳)73第 1 期罗兰萍等:Pt/Ni Co/CNTs 催化剂的制备及其电化学性能研究