ELISA技术方法原理.pptx

ELISA 的发展50年代的免疫荧光（年代的免疫荧光（IFA）和）和0年代的放射性免疫年代的放射性免疫（RIA）分析技术之后，）分析技术之后，0年代初又建立了用酶年代初又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术来标记抗原或抗体的分析技术191年此项技术由瑞典学者年此项技术由瑞典学者 Engvall 和和Perlmann，荷兰学者，荷兰学者Van Weeman和和 Schuurs分别报道，将分别报道，将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附测定法（测定方法，称为酶联免疫吸附测定法（ELISA）ELISA的应用ELISA法在生物医学各领域的应用范围概法在生物医学各领域的应用范围概括为四个方面括为四个方面免疫酶染色各种细胞内成份的定位。免疫酶染色各种细胞内成份的定位。研究抗酶抗体的合成。研究抗酶抗体的合成。显现微量的免疫沉淀反应。显现微量的免疫沉淀反应。定量检测体液中抗原或抗体成份。定量检测体液中抗原或抗体成份。ELISA基本 原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关 在ELISA方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：双抗体夹心法测抗原（常用）夹心法 双抗原夹心法测抗体间接法测抗体（常用）竞争法测抗原竞争法 竞争法测抗体捕获包被法测抗体亲和素-生物素 ELISA法包被特异性抗体包被特异性抗体加入待测样品加入待测样品加酶标特异性抗体加酶标特异性抗体底物显色底物显色洗涤洗涤孵育洗涤孵育双抗体夹心法测抗原待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单价抗原的测定。双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定。乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗原。间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法。原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的 受检抗体，故称为间接法。操作步骤：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相 抗原，洗涤。（2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固 相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。（3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。间接法的特点本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。一酶标抗体检测相应抗体。间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。响包被效果。竞争法测抗原操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，孵育后，酶标抗原与固相抗体的结合最充分。竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。捕获包被法测抗体样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法。先将所有样品IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：（1）将）将抗抗IgM抗体抗体连接连接在固相载体上，形成固相在固相载体上，形成固相抗抗IgM，洗涤。，洗涤。（2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的IgM抗体被抗体被固相抗体捕获，洗涤。固相抗体捕获，洗涤。（3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性IgM结合，洗涤。结合，洗涤。（4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固相上的）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合，洗涤。抗原反应结合，洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在特）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在特异性异性IgM抗体，是为阳性反应抗体，是为阳性反应。亲和素-生物素-ELISA法亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复合体。把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。适用于适用于优点优点注意注意双抗体夹心法测抗原是检测抗原最常用的方法，适用于检验各种蛋白质等大分子抗原特异性高不能检测小分子抗原及半抗原双抗原夹心法测抗体乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。间接法测抗体是检测抗体最常用的方法,本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体 1.关键抗原的纯度2.另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体 竞争法测抗原小分子抗原如激素和药物等ELISA测定多用此法。快，只有一次保温洗涤过程需要较多的酶标记抗原方法方法适用于适用于竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检验特异性抗体捕获包被法测抗体主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定ABS-ELISA 法ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。