PCR反应原理.pptx

n1985年年 美国美国PE-cetus公司人类遗传研究室公司人类遗传研究室的的Kary mullis发明了具有划时代意义的发明了具有划时代意义的PCR技术技术 n1988年年 美国美国PE-cetus公司推出世界上第一公司推出世界上第一台台PCR热循环仪，从而使热循环仪，从而使PCR反应自动化反应自动化 n1993年年 Kary Mullis因发明因发明PCR技术获得诺技术获得诺贝尔化学奖贝尔化学奖 n1995年年 定量定量PCR仪诞生，使定量研究仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实靶序列成为现实 PCRPCR技术的诞生与发展技术的诞生与发展Kary Mullis第1页/共15页PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程（一）（一）PCR基本组成：基本组成：u模板DNAu引物u4种脱氧核糖核苷酸uDNA聚合酶u其他（Mg2+、化学物质等）（二）（二）DNA的体外复制的步骤：的体外复制的步骤：1、变性、变性（90-96）2、退火、退火（25-65）3、延伸、延伸（70-75）每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。第2页/共15页、变性（、变性（denaturationdenaturation）双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。第3页/共15页2、复性、复性(renaturation)（退火，（退火，annealing）系统温度降低，引物与系统温度降低，引物与DNA模板结模板结 合，形成局部双链。合，形成局部双链。影响复性速度的因素：DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度第4页/共15页3、延伸（、延伸（extension）在Taq酶（在72左右，活性最佳）作用下，以dNTP为原料，从5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。第5页/共15页常用的荧光定量常用的荧光定量PCR方法方法SYBR Green I Taqman水解探针水解探针第6页/共15页SYBR Green I结合到双链结合到双链DNA的小沟部位的小沟部位只有与双链只有与双链DNA结合后才发荧光结合后才发荧光SYBR 与与dsDNA 结合，并且受结合，并且受到激发的时候，可以发出绿色荧到激发的时候，可以发出绿色荧光光 第7页/共15页SYBR Green I 工作原理工作原理未结合的未结合的SYBR green ISYBR green I第8页/共15页TaqMan Probes（探针）（探针）荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂淬灭剂淬灭剂 与目标序列互补与目标序列互补FAMTETJOEHEXVICTAMRA TaqMan 探针的机理探针的机理 DNA聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测 第9页/共15页TaqMan ProbesTaqMan Probes工作原理工作原理 光光光光能量转移能量转移能量转移能量转移Taq游离的探针游离的探针游离的探针游离的探针荧光基团荧光基团荧光基团荧光基团 淬灭剂淬灭剂淬灭剂淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 TaqTaqTaqTaq发出荧光发出荧光发出荧光发出荧光光光光光另一波长的荧光另一波长的荧光另一波长的荧光另一波长的荧光第10页/共15页第11页/共15页 荧光定量荧光定量PCRPCR与常规与常规PCRPCR的区别的区别q常规常规PCR技术技术 对对PCR扩增的扩增的终产物终产物进进行定性及定量分析行定性及定量分析q荧光定量荧光定量PCR技术技术 实时监测实时监测PCR扩增反应扩增反应中中每一个循环的产物每一个循环的产物定量分析定量分析第12页/共15页Ct与初始模板的关系与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号固定循环数后，荧光信号与模板数成正比与模板数成正比固定荧光信号值后，模板固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比数就与循环数成反比初始初始DNADNA量越多量越多,荧光达到荧光达到阈值时所需要的循环数阈值时所需要的循环数(Ct(Ct 值值)越少越少起始模板的对数浓度与起始模板的对数浓度与CtCt呈线性关系，根据样品的呈线性关系，根据样品的CtCt值就可计算出样品中所含的值就可计算出样品中所含的模板量模板量Threshold104103102第13页/共15页实时荧光定量实时荧光定量PCR的特点的特点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高可直接对产物进行定量可直接对产物进行定量自动化程度高、操作简单自动化程度高、操作简单第14页/共15页第15页/共15页