QTRAP用户会之二MRM定量.pptx

1 2010 AB SCIEXMRM3 定量:三级四极杆传统定量方法是MRM 典型的是单位质量分辨(0.7 amu FWHH)(通常特异性足够)不幸的是，仍然会有干扰如果能早期发现，还能修改方法，如果已经确认，将花费大量的时间和资源克服这个问题2 2010 AB SCIEXMRM3,在定量上增加在定量上增加选择性性 消除干消除干扰;建立置信度建立置信度!区区别于于3D离子阱的离子阱的MS3,专用在定量方面用在定量方面,故称故称为MRM33 2010 AB SCIEX如何解决干扰问题消除干扰可以1.色谱2.变换碎片离子 for MRM3.改变 CE4.提高母离子的选择性优点操作容易LC 时间不受影响LC 时间不受影响提高Q1分辨率容易做到缺点延长分析时间影响灵敏度影响灵敏度降低灵敏度4 2010 AB SCIEX当当FWHH0.7降到降到0.1时，分辨率升高，时，分辨率升高，但是灵敏度会损失但是灵敏度会损失50%以上以上分辨率与灵敏度关系分辨率与灵敏度关系分辨率与灵敏度关系分辨率与灵敏度关系图图解解解解Finnigan 高分辨率的定量高分辨率的定量分析分析(H-SRM)，FWHH=0.2，此时灵敏度损失，此时灵敏度损失20%20%Loss70-75%Loss0.06 amu FWHH5 2010 AB SCIEXFinnigan promotes Hi-Res Quantitation at 0.2 FWHH使用使用4000 Q TRAP 进行定量分析，单位分辨率时进行定量分析，单位分辨率时MS3 的特异性，相当于的特异性，相当于 MS2 FWHH=0.03分辨率分辨率分辨率分辨率/传输传输率率率率90%LossFor H-SRM0.03 amu FWHHMSMS2 2的前体离子选择的分辨率的前体离子选择的分辨率的前体离子选择的分辨率的前体离子选择的分辨率达到达到达到达到FWHH0.03amuFWHH0.03amu时，灵敏时，灵敏时，灵敏时，灵敏度损失超过度损失超过度损失超过度损失超过90%90%6 2010 AB SCIEX干扰概率:MS,MS/MS and MS3 vs.Resolution100%0.25%0.03 amu要得到与单位分辨率时MS3相同水平的定量分析特异选择性，MS2的前体离子选择的分辨率需达到FWHH0.03amu7 2010 AB SCIEXMS3 实验:Q1 分析 Q2 裂解 LIT 分离/裂解/贮存/扫描 特异的定量通路 消除干扰 比提高Q1分辨率更通用定量由Q0Q1q2Q3LIT8 2010 AB SCIEXMRM3 定量:实验条件:3 种化合物有相同的整数质量和碎片离子在快速色谱条件下可分析5-500 pg50 ng2.5 ngOn column流动相:A)95:5 H2O:ACN 5mM NH4OAc 0.1%FormicB)95:5 ACN:H2O 5mM NH4OAc 0.1%FormicGradient elution over 7 minutes色谱柱:Luna C18(2)5(2.1x50mm)流速：350 L/minMRM on 4000 Q TRAP (Optimal CE)Pamaquin(10pg)in presence of Oxycodone(50ng)and Clonazepam(2.5ng)OxycodonePamaquinClonazepamClonazepamClonazepamPamaquin(ABSENT)Pamaquin(ABSENT)MRM 316/243MRM 316/241MRM 316/187OxycodonePamaquinClonazepamClonazepamClonazepamPamaquinPamaquinOxycodoneMRM 316/243MRM 316/241MRM 316/187MRM on 4000 Q TRAP (CE 45eV)Pamaquin(100pg)in presence of Oxycodone(50ng)and Clonazepam(2.5ng)MS3 316/243/187Summed ions of187 and 174MRM3 on the 4000 Q TRAPPamaquin(5pg)in presence of Oxycodone(50ng)and Clonazepam(2.5ng)MS3 316/243/241Summed ions of 187 and 174 MS3 316/243/187MRM3 on the 4000 Q TRAPPamaquin(10pg)in presence of Oxycodone(50ng)and Clonazepam(2.5ng)13 2010 AB SCIEX为什么复合型四极杆什么复合型四极杆-线性离子阱是不同的性离子阱是不同的?-第一级裂解是在单位分辨率下完成-第一级裂解碎片丰富(碰撞室)-第一级裂解快速(不需要分离时间)-第二级裂解高效率(70-80%)-第二级裂解有单位分辨率特性(单频率)-MS3循环时间能在200-300msec完成(包括充满，分离，激发和扫描)14 2010 AB SCIEXMRM3 定量:通常定量可以做如下一项或多项:选择3种不同子离子 每种离子对分配 3 种不同CE 色谱 Q1 和 Q3分辨率但是,MRM3 定量能消除上述4点考虑!如果你什么干扰都不知道的话。MRM3 将给你特异性和置信度。15 2010 AB SCIEXMRM3 Experiments:MS3 of Alprazolam(309/281/205)4000 amu/secCycle time=176 msecLOQ=1.25 pg on column实例：使用 MRM模式定量分析 AlprazolamMRM 309/205 500 fgMS3 309/281/205 1.25 pg可见，灵敏度只降低2.5倍，却可达到FWHH=0.03时的定量特异性，定量不确定性只有0.25%16 2010 AB SCIEX使用4000QTRAP的MRM3进行定量，其单位分辨率的选择特异性，相当于FWHH=0.03amu（MS2），干扰概率只有0.25%，而其灵敏度相对于MS/MS定量,只降低2.5倍17 2010 AB SCIEXMRM3 Quantitation using the QTRAP 5500 system18 2010 AB SCIEX10g/kg in Matrix(MRM3:%CV5,accuracy 90-110%)S/N=922S/N=8S/N=497S/N=147XIC of+MRM(4 pairs):330.9/126.Max.1.0e5 cps.0.00.51.01.52.02.53.03.54.0Time,min0.002.00e44.00e46.00e48.00e41.00e5Intensity,cps2.1XIC of+MS3(330.90),(127.10):E.Max.2.8e7 cps.0.00.51.01.52.02.53.03.54.0Time,min0.05.0e61.0e71.5e72.0e72.5e72.8e7Intensity,cps2.1XIC of+MRM(4 pairs):330.9/98.Max.4.5e5 cps.0.00.51.01.52.02.53.03.54.0Time,min0.05.0e41.0e51.5e52.0e52.5e53.0e53.5e54.0e54.5e5Intensity,cps2.1XIC of+MS3(330.90),(99.00):Ex.Max.2.9e7 cps.0.00.51.01.52.02.53.03.54.0Time,min0.05.0e61.0e71.5e72.0e72.5e72.8e7Intensity,cps2.1XIC of+MRM(4 pairs):330.9/98.Max.4.5e5 cps.0.00.51.01.52.02.53.03.54.0Time,min0.05.0e41.0e51.5e52.0e52.5e53.0e53.5e54.0e54.5e5Intensity,cps2.1XIC of+MS3(330.90),(99.00):Ex.Max.2.9e7 cps.0.00.51.01.52.02.53.03.54.0Time,min0.05.0e61.0e71.5e72.0e72.5e72.9e7Intensity,cps2.1XIC of+MRM(4 pairs):330.9/126.Max.1.0e5 cps.0.00.51.01.52.02.53.03.54.0Time,min0.002.00e44.00e46.00e48.00e41.00e5Intensity,cps2.1XIC of+MS3(330.90),(127.10):E.Max.2.8e7 cps.0.00.51.01.52.02.53.03.54.0Time,min0.05.0e61.0e71.5e72.0e72.5e72.8e7Intensity,cps2.1XIC of+MRM(4 pairs):330.9/98.Max.4.5e5 cps.0.00.51.01.5331/99/71matrix interferenceMRM331/127MRM331/99MRM3331/127/99331/99/71matrix interferenceMRM319 2010 AB SCIEXCalcitriol with 18 min 2-D Chromatography MRM20 2010 AB SCIEXQTRAP 5500 systemMRM3Fast ChromatographyAPI 5000 systemStandard MRM2D ChromatographyCalcitriol MRM vs MRM321 2010 AB SCIEX实例例-克克伦特特罗Clenbuterol analysis from Urine sampleCalibration curves prepared from pooled matrix Subject 1 to 18 pooled to prepare standard calibration curveThis mimics approach used in typical bioanalysisTotal of 34 subject samples(including the 18 pooled together for calibration curve)were analyzed as individual samples at 3 levels of clenbuterol0 pg/uL of clenbuterol(unspiked blank)0.5 pg/uL of clenbuterol(apporximate)Previous sample diluted 2 fold(0.25pg/uL)All Subject samples injected randomlyCalibration curve injected in 4 replicates MRM monitored 277-203/277-168 /277-132MRM3 277203168/277203132