梭鲈ho1基因的克隆及其低氧胁迫下表达分析_吉宇丹.pdf

DOI:10.12131/20220187文章编号：2095 0780（2023）02 0098 09梭鲈 ho1 基因的克隆及其低氧胁迫下表达分析吉宇丹1,2，孙志鹏1，吕伟华1，鲁翠云1,2，曹顶臣1，刘天奇1，周 佳1,2，郑先虎1,21.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所/农业农村部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 1500702.上海海洋大学/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306摘要：梭鲈(Sander lucioperca)对低氧极敏感，在集约化养殖和苗种运输过程中易发生低氧应激和死亡现象。为探究血红素加氧酶1(Heme oxygenase 1,HO1)在梭鲈响应低氧过程中的调节作用，通过RACE(Rapid amplification of cDNAends)技术克隆了梭鲈ho1基因，其cDNA全长为1 256 bp，包含840 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF)、162 bp的5非编码区(Untranslated region,5-UTR)和254 bp的3-UTR，编码279个氨基酸。多重序列比对显示，梭鲈HO1与翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)、舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)和大口黑鲈(Micropterus salmoides)的氨基酸序列相似性分别为91.84%、88.69%和88.11%。实时荧光定量结果显示，ho1基因在所有检测组织中均有表达，其中在脑组织中高表达，其次是肾、肝、鳃等组织。低氧刺激前3 h，梭鲈ho1主要在皮肤、鳃中响应；低氧胁迫3 h后，ho1主要在心、肝、肾中发挥转录调控作用。复氧12 h，除肝脏外，梭鲈其他组织ho1的相对表达量均可恢复正常，低氧刺激对肝组织ho1的表达产生了较大影响。研究表明，ho1基因参与梭鲈响应低氧的分子调节机制并在其中发挥着重要的生物学功能，可为深入了解梭鲈低氧胁迫遗传机制提供理论参考。关键词：梭鲈；ho1；基因克隆；低氧胁迫；基因表达中图分类号：S 965.1文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Characterization and expression analysis of ho1 from Sander luciopercaunder acute hypoxia stressJI Yudan1,2,SUN Zhipeng1,LYU Weihua1,LU Cuiyun1,2,CAO Dingchen1,LIU Tianqi1,ZHOU Jia1,2,ZHENG Xianhu1,21.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences/Key laboratory of Freshwater Aquatic Biotech-nology and Breeding,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Harbin 150070,China2.Shanghai Ocean University/Key Laboratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Shanghai 201306,ChinaAbstract:Sander lucioperca is extremely sensitive to hypoxia,and is prone to hypoxia stress and death during intensive breed-ing and seedling transportation.In order to investigate the regulating effect of heme oxygenase 1(HO1)in the response to hypo-xia of S.lucioperca,we cloned the full-length cDNA sequence of ho1 gene by RACE(Rapid amplification of cDNA ends)techno-logy.The results indicate that the cDNA length was 1 256 bp(840 bp ORF,162 bp 5-UTR and 254 bp 3-UTR),encoding 279amino acids.The multiple sequence alignment shows that the similarity of HO1 with Siniperca chuatsi,Dicentrarchus labrax andMicropterus salmoides was 91.84%,88.69%and 88.11%,respectively.Real-time quantitative PCR discloses that ho1 was ex-pressed in all the tested tissues,with the highest concentration in the brain,followed by the kidney,liver and gills.During the第 19 卷第 2 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.22023 年 4 月South China Fisheries ScienceApr.，2023收稿日期：2022-07-05；修回日期：2022-08-16基金项目：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(HSY202009Q)；国家重点研发计划项目(2019YFD0900405)；中央引导地方科技发展专项(ZY21C03)；国家淡水水产种质资源库项目(FGRC18537)作者简介：吉宇丹(1997)，女，硕士研究生，研究方向为水产生物技术与遗传育种。E-mail:通信作者：郑先虎(1982)，男，研究员，博士，研究方向为水产生物技术与遗传育种。E-mail:first 3-hour hypoxic stimulation of Pikeperch,ho1 primarily responded in the skin and gills,but mainly played transcriptionalregulatory roles in the heart,liver and kidney after 3 h of hypoxic stress.At 12th hour of reoxygenation,the expression levels ofho1 in all the tissues except the liver returned to a normal level,and hypoxia stress had an enormous effect on the expression ofho1 in the liver.The study reveals that ho1 gene is involved in the molecular regulation mechanisms of S.lucioperca in responseto hypoxia and plays an important biological role,which provides theoretical references for understanding the genetic mechani-sm of hypoxic stress.Keywords:Sander lucioperca;ho1;Gene clone;Hypoxia stress;Gene expression低氧环境影响鱼类的生存、生长、繁殖和代谢等生命活动1-3。为适应低氧环境，鱼类在长期进化中形成了一系列的低氧适应机制，由低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIF)介导的低氧信号传导途径在环境缺氧应答机制中起主导作用4。血红素加氧酶 1(Heme oxygenase 1,HO1)是血红素降解过程中的起始酶和限速酶，可将血红素降解形成胆绿素、一氧化碳(CO)和游离铁，这三种代谢产物均是机体重要的生物效应分子，可以保护细胞免受氧化应激损伤5；ho1 是 HIF 信号通路的靶基因之一，具有重要生物学功能。目前，ho1 序列及其表达特征已在多种鱼类中报道，如斑马鱼(Daniorerio)6、舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)7、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)8、团头鲂(Megalobramaamblycephala)9、南亚野鲮(Labeo rohita)10等。研究表明，鱼类 ho1 在低氧刺激下能够为细胞提供保护作用。如鲫(Carassius auratus)ho1 对于抗低氧诱导的细胞凋亡具有重要作用，可保护细胞应对低氧刺激11；ho1 可调节金鱼(C.auratus)对低氧的呼吸反应12；斑马鱼 ho1 可通过抗细胞凋亡发挥低氧保护作用13。梭鲈(Sander lucioperca)隶属鲈形目、鲈科、梭鲈属，具有生长速度快、抗病能力强、肉质细嫩、营养价值高14等特点，在欧洲具有较高的市场认可度15。20 世纪 90 年代我国梭鲈人工繁育取得成功，目前在东北、西北、华北、华东、华南等地区均有养殖，已成为我国重要的淡水名优养殖鱼类。梭鲈为凶猛性鱼类，性情急躁，应激反应强烈，对低氧极为敏感。研究显示，梭鲈养殖的最佳溶解氧(DO)质量浓度为 79 mgL116，因此在集约化养殖和苗种运输过程中容易发生低氧应激、死亡等现象。目前，关于梭鲈对低氧的耐受性及其适应机制研究报道较少，Baekelandt 等17研究发现，养殖水域的 DO 质量浓度为 46 mgL1时，梭鲈的采食量和生长速度均降低；Nadine 等3报道，在DO 质量浓度为 3.2 mgL1的缺氧环境中，梭鲈头肾中淋巴细胞数量下降，头肾和肝脏中的免疫和应激基因(包括 fth1、hif1a 和 nr3c1)表达量下调。可见低氧显著影响到梭鲈的生长、免疫调节等重要生命活动，但有关梭鲈低氧应激分子机制的研究尚不多见，血红素加氧酶 1 在低氧胁迫下的响应机制尚不清楚。本研究通过对梭鲈低氧相关基因 ho1 的克隆及序列特征分析，探讨了梭鲈 ho1 在各组织中的表达模式，并检测了低氧、复氧下皮肤、鳃、心、肾、肝、脑中 ho1 的表达规律，以期为梭鲈养殖、运输等技术研发提供数据支持，同时也为梭鲈耐低氧机制研究、耐低氧育种提供理论参考。1 材料与方法 1.1 实验动物实验用梭鲈来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰试验场。选取体格健壮、体表无伤、规格基本一致的 1 龄梭鲈 220 尾，体质量(736)g，体长(20010)mm，于实验室循环水系统水族箱中暂养 7 d，正常投喂配合饲料。暂养期间，保持 DO 质量浓度大于 8 mgL1，水温(180.2)。实验前禁食 24 h。1.2 低氧胁迫与恢复试验取 30 尾实验鱼，放入密闭水族箱中，用于测试“浮头点”。低氧胁迫前，采用 YSI 多功能水质分析仪测得 DO 质量浓度为 9.9 mgL1，水温 18。停止增氧，观察鱼的活动情况，当实验鱼开始因低氧而浮在水面吞食空气时，则达到“浮头点”，此时水中 DO 质量浓度为 3.5 mgL1。因此，本实验将低氧胁迫 DO 质量浓度设定为 3.5 mgL1。取 90 尾实验鱼平均放至于 3 个循环水族箱中作为常氧对照组(DO 质量浓度 10 mgL1)，90 尾实验鱼平均放至于 3 个密闭水族箱中作为低氧胁迫组(DO 质量浓度 3.5 mgL1)。停止增氧，向水中持续充氮气(N2)，使水体 DO 质量浓度降至 3.5第 2 期吉宇丹等:梭鲈 ho1 基因的克隆及其低氧胁迫下表达分析99NH+4mgL1，之后调节氮气(N2)与氧气(O2)充入量使水体 DO 质量浓度保持在(3.50.3)mgL1，维持9 h。每间隔 15 min 用水质分析仪监测水体温度、pH、DO、氨氮(-N)等。低氧实验结束后，将胁迫组梭鲈转至 3 个循环可控水族箱中(DO 质量浓度 10 mgL1)，进行常氧恢复实验，并维持 12 h。此次实验均使用直径 30 cm、长 100 cm 的水族箱，且放置 1 个气石；除水族箱中 DO 条件存在差异，其他水质条件均一致。1.3 样品采集和保存用 MS-222 对实验鱼进行麻醉，分别在常氧对照组，低氧胁迫第 3、第 6、第 9 小时，常氧恢复第 0.5、第 1、第 2、第 3、第 6、第 9、第 12 小时，在每个水族箱随机选取 3 尾鱼，采取皮肤、肌肉、心、肝、肾、肠、脑、鳃组织样本，并迅速投入液氮中冷冻备用。1.4 总 RNA 提取及 cDNA 第一链的制备将皮肤、肌肉、心、肝、肾、肠、脑、鳃组织样品从液氮罐取出，剪取 12 mg 置于事先加入500 L Trizol 的离心管中，使用手持匀浆仪(QIA-GEN)匀浆至无颗粒状态，参考 Trizol 法提取样品总 RNA。利用紫外分光光度计(NanoDrop 8000)及 1.2%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 浓度及完整性(图 1)。使用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)去除基因组 DNA、反转录合成 cDNA 第一链，于80 保存备用。1.5 梭鲈 ho1 基因全长 cDNA 的获得根据 NCBI 数据库中河鲈(Perca fluviatilis)、舌齿鲈及其他鲈科鱼类 ho1 基因的 cDNA 序列，选择保守区域与梭鲈转录组数据库进行序列比对，获得梭鲈 ho1 基因的部分 cDNA序列。利用 Primer 3Plus 软件设计 PCR 特异性引物(表 1)，以梭鲈鳃组织 cDNA 为模板，对其开放阅读框(Open readingframe,ORF)进行 PCR 扩增，用 1.2%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物(图 2)，参考胶回收试剂盒(康为世纪)纯化目的片段，再连接至 PMD-18T 载体(TaKaRa)、转入 E.coli DH5 感受态细胞(TaKaRa)，使用 LB 培养基(含氨苄)筛选阳性克隆，并测序验证。根据已获得梭鲈 ho1 基因 ORF 序列设计 RACE(Rapid amplification of cDNA ends)引物，参考SMARTer RACE 5/3试剂盒(TaKaRa)说明书构建RACE 文库。使用 SeqAmpTM DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒并结合巢氏 PCR 法进行 RACE 扩增(图 2)。扩增产物的回收纯化及克隆同以上ORF 序列的获得。引物合成及菌落测序均由苏州表1 引物序列Table 1 Primers used in this study基因Gene目的Purpose引物Primer引物序列(53)Primer sequence(53)退火温度Annealing temperature/ho1ORF扩增ho1-F1GGAGCCAGAGAAGAAGACTCAG59.8ho1-R1TGCAGCTCGTTTTCAGTGAC60.2ho1RACE扩增5GSPACACCGGGGAAGGCGAAGAATGAC72.05nGSPCACTGGGGTGGTTGGAGTTCCTGTC70.93GSPGAGGGCAGGTCCTGGGTCGAATC71.23nGSPATGGGGCTAAAGGGCAGCGAAGGTC73.2ho1RT-PCRho1-F1CTGTGCTCGCTGTATGAGGT59.1ho1-R1CCAGTCCTGGCCATAGAAGT59.2gapdhRT-PCRgapdh1-FATGTTCGTCATGGGCGTCAA60.0gapdh1-RCAGGCCCTCAATGATGACGA60.0脑Brain肾Kidney肝Liver鳃Gill肠Intestine心Heart皮肤Skin肌肉MuscleM28S18S图1 梭鲈各组织总RNA电泳图Fig.1 Electrophoresis of total RNA in tissues of S.lucioperca100南 方 水 产 科 学第 19 卷金唯智生物科技有限公司完成。测序结果经 BLAST(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，DNAMAN 软件拼接、分析，最终获得梭鲈 ho1 基因全长 cDNA 序列。1.6 梭鲈 ho1 基因序列的生物信息学分析使用 NCBI 上 ORF Finder(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)工具查找各基因开放阅读框，进一步推导出氨基酸序列。使用 SMART(http:/smart.embl-heidelberg.de/)和 NCBI 在线工具查找基因的蛋白功能结构域。通过 EXPASY(https:/web.expasy.org/protparam/)在线分析软件分析功能域、分子式、理论等电点、信号肽、蛋白疏水性、跨膜结构、蛋白质二级结构等。采用 DNAMAN 软件进行氨基酸序列多重对比；使用 MEGA 7.0 软件的邻接法(Neighbor-Joining method,NJ)构建系统发育进化树,其中 Bootsrap(1 000 次)得出各分支置信度。1.7 梭鲈 ho1 在各组织表达规律分析为确定梭鲈 ho1 的组织表达特异性模式，根据已获得 ho1 基因的编码序列设计 RT-PCR(Real-time quantitative PCR)引物(表 1)，以梭鲈 gap-dh 为内参基因，以上获得各组织的 cDNA 为模板，使用 TB Green Premix Ex Taq TM II(Tli RNaseHPlus)试剂盒(TaKaRa)，ABI 7500 荧光定量 PCR仪，检测梭鲈 ho1 基因在常氧对照、低氧胁迫及复氧中各个组织的表达情况，每个样本至少设置 3 个平行。采用 2Ct法18计算目的基因的相对表达量，SPSS 17.0 软件中的单因素方差分析(One-wayANOVA)方法对数据进行处理和检验分析，P0.05表示差异显著。组织样本总 RNA 的提取、cDNA 第一链的制备，方法参考 1.4.1。2 结果 2.1 梭鲈 ho1 基因全长 cDNA 序列分析根据基因保守序列的同源扩增法、RACE 技术，经克隆拼接，得到梭鲈 ho1 基因全长 cDNA序列。梭鲈 ho1 cDNA 序列全长 1 256 bp，包括 840 bp的开放阅读框、162 bp 的 5非编码区(5-UTR)和254 bp 的 3-UTR，编码 279 个氨基酸，在 3-UTR 区 PolyA 上游 43 bp 处有一个“AATAAA”加尾信号。梭鲈HO1蛋白分子式为C1412H2253N377O424S12，相对分子质量 31.68 kD，理论等电点(pI)6.04，其中异亮氨酸(Leu)含量最高，占比 12.5%。蛋白总平均亲水性为 0.288，不稳定系数为 40.59，说明该蛋白为亲水性不稳定蛋白。经 TMHMM 和 Sig-nal.4 预测，HO1 蛋白无信号肽位点，N 末端第256第 278 位氨基酸处有一个跨膜结构域(图 3)，前 255 个氨基酸位于细胞膜内，第 279 位氨基酸在细胞膜外，说明 HO1 在细胞中具有跨膜转运的功能。除此之外，SMART 在线工具推测出梭鲈 HO1还拥有一个 Pfam 功能结构域(图 3)，位于第 17第 221 位氨基酸，是 HO1 蛋白发挥其催化功能的区域，也是血红素加氧酶家族共有的保守功能域。2.2 氨基酸序列比对及系统发育进化树的构建使用 Blast 在线分析工具对梭鲈 ho1 编码的蛋白进行同源性搜索，发现不同物种 HO1 氨基酸序列有较高相似度(图 4)，梭鲈 HO1 与翘嘴鳜(Sini-perca chuatsi)、舌齿鲈、大口黑鲈(Micropterus sal-moides)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、军曹鱼(Rachycentron canadum)同源性分别为 91.84%、88.69%、88.11%、87.28%、84.77%。在 NJ 系统发育进化树中(图 5)，梭鲈先与鲈形目鱼类聚在一起，再与鸟纲、两栖纲、爬行纲聚为一支，而哺乳动物则单独聚为另一支。2.3 梭鲈 ho1 基因在不同组织的表达模式利用实时荧光定量 PCR 技术检测梭鲈 ho1 基因在组织中(皮肤、肌肉、心、肝、肾、肠、脑、鳃)的表达情况，结果显示(图 6)，常氧条件下ho1 广泛分布于各个组织，但出现明显的组织差异M23bp1 000750500250100bpM11 000750500250100M.DL2000 Marker；1.鳃组织中ORF 扩增结果；2.鳃组织5末端扩增结果；3.鳃组织3末端扩增结果。M.DL2000 Marker;1.ORF of gill;2.5 RACE of gill;3.3 RACE of gill.图2 梭鲈ho1基因PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR products of ho1 in S.lucioperca第 2 期吉宇丹等:梭鲈 ho1 基因的克隆及其低氧胁迫下表达分析101性。ho1 在脑中的表达量最高，且相较其他组织呈现极显著性差异(P0.01)；其次是肝、肾、鳃、肠，而在皮肤和肌肉中的表达量较少。2.4 低氧胁迫和复氧对梭鲈 ho1 表达的影响在低氧胁迫过程中，ho1 在梭鲈皮肤、鳃中的变化更迅速，其表达量极显著升高(图 7-a、7-b)，分别在第 3、第 6 小时迅速升至最高点，而后开始下降；复氧第 0.5 小时，皮肤 ho1 持续下降，鳃ho1 则显著升高，之后均呈现升高-降低的表达趋势，但鳃组织的相对表达量变化较不稳定；至复氧第 9 小时，ho1 在梭鲈皮肤、鳃中表达量基本可恢复至正常水平。在低氧胁迫前 3 h，梭鲈心、肾、1 ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagtacatggggagagcacaaactgtactgcacatccagcgagaaaaca M E P E K K 6 91 gtgaatcactgtgaacatagatcaacctacctaactaccaaaccatcagaactttatcctaactgggctgcaATGGAGCCAGAGAAGAAGT Q T T S E Q M T D R D L S E Q I K K V T K D S H V R A E N 36 181 ACTCAGACGACATCAGAGCAGATGACTGACAGGGATCTGTCAGAACAAATCAAAAAGGTGACAAAGGATAGTCACGTCAGGGCAGAAAACT E L M L S F Q K G K V T L P Q Y K L L L C S L Y E V Y Q A 66 271 ACAGAACTGATGCTGAGCTTCCAGAAGGGAAAAGTCACCCTGCCACAGTACAAGCTCCTTCTGTGCTCGCTGTATGAGGTCTACCAGGCCL E E E M D R N S N H P S V A P I Y F P A E L A R L E A I E 96 361 TTGGAGGAAGAGATGGACAGGAACTCCAACCACCCCAGTGTTGCACCCATTTACTTCCCGGCTGAACTGGCCAGACTGGAGGCCATCGAGK D L E Y F Y G Q D W R E K I V V P A A T K R Y C H R L R Q 126 451 AAAGACCTGGAATACTTCTATGGCCAGGACTGGAGAGAGAAGATTGTTGTCCCTGCAGCCACTAAAAGATACTGCCACAGACTCAGACAAI G K E N P E F L V A H A Y T R Y L G D L S G G Q V L G R I 156 541 ATTGGTAAAGAAAACCCAGAATTTTTGGTTGCCCATGCTTACACTAGGTACCTAGGTGACCTGTCTGGAGGGCAGGTCCTGGGTCGAATCA Q K S M G L K G S E G L S F F A F P G V S S P N L F K Q L 186631 GCCCAGAAGTCCATGGGGCTAAAGGGCAGCGAAGGTCTGTCATTCTTCGCCTTCCCCGGTGTGTCCAGTCCCAACCTGTTCAAACAGCTGY R S R M N S V E L T E E E R N G V L E E A V R A F E L N I 216 721 TATCGCAGCCGGATGAACAGCGTGGAGCTGACGGAGGAGGAGAGGAACGGCGTGCTGGAGGAGGCTGTCAGAGCGTTTGAGTTAAACATTQ V F D G L Q M L L S V T E N E L Q T C S T H S T P V N T L 246 811 CAGGTCTTTGACGGTTTGCAGATGTTGCTGAGTGTCACTGAAAACGAGCTGCAGACATGTTCAACACACTCCACACCAGTAAATACACTC Q I P K T I I K T T P L L R M V L G L L V A L A T V S M G I 276280 901 CAGATCCCCAAAACCATCATCAAAACTACCCCACTGCTCAGGATGGTGCTCGGACTTTTGGTGGCTCTGGCCACAGTCAGTATGGGAATC Y A F 991 TATGCTTTTTAGagaagatacacacaaaaaaataccatgtgttggtctgtttctgtaagaccattaaaaacttgtaagattttaaatgac1081 aaaatactgtatatttttatgaaagttgagtgtaatgatttttgaaatctattttatgtctaacactgttatccagtgtgcattaaaatg1171 tgcaatacatgtgcttttaatcctgtaaatatgttatctttgtaataaaatcttgttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa*大写字母代表开放阅读框；小写字母代表5-UTR和3-UTR；灰色阴影表示起始密码子和终止密码子；下划虚线表示跨膜结构域(256278)；下划实线表示Pfam功能结构域(17221)；方框表示细胞膜外氨基酸残基。Uppercase letters in cDNA represent open reading frame(ORF);lowercase letters represent the 5-UTR and 3-UTR;grey shadings indicate the start code(ATG)and the termination code(TAG);transmembrane domain(256278)is highlighted by dotted line;Pfam functional domain(17221)is highlighted by underline;extracellular amino acid residues is marked with a rectangular frame.图3 梭鲈ho1基因cDNA全长序列及推导的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and predicted protein sequences of ho1 of S.luciopercaMMMMEEEEPPSREE.KK.KK.TTT.QQK.TTS.TTKPSSPQEERPQQDDMMSSTTTMDDGPRRSQDDDDLLLLSSSSEEEEQQQAIIILKKKKKKAEVVVATTTTKKKKDDDESSSVHHHHVVVTRRRQAAAAEEEENNNNTTTAEEQELLLFMMMMLLLRSSSNFFYFQQQQKKKKGGGGKKQQVVIVTTTTLLPRPPTDQQQGYYYFKKKKLLLLLLLVLLLMCCCASSSSLLLLYYYYEEEHVVIIYYYYQQQVAAAALLLLEEEEEEEEEEEEMMLIDDDERRRRNNNNSSAKNNAEHHHSPPPPSSAVVVVFAAQAPPPPIIIVYYYYFFFFPPPPAAQEEEEELLLLAAAHRRRRLLLKEEEAAASAIILLEEEEKKLQDDDDLLLLEEEAYYHFFFFWYYFYGGGGQQPPDDHRWWWWRRRQEEKEKKRVIIVIVVTPVVVYPPPTAAAPAAAATTTMKKHQRRRRYYYYCCTVHHQKRRRRLLLLRRRHQQEEIIIVGGGGKKKREENTNNSEPPPPEEDEFFLLLLLLVVVVAAAAHHHHAAAAYYYYTTTTRRRRYYYYLLLLGGGGDDDDLLLLSSSSGGGGGGGGQQQQVVVVLLLLGGGKRRKKIIIIAATAQQQQKKKKSSSAMMLLGGGDLLLLKKSPGGGSSSNS.GEEKEGGGGLLILSSLAFFFFFFFFAASTFFFFPPPPGGGNVVVISSSASSSSPPPANNNTLLRKFFFFKKKKQQQQLLLLYYYYRRRRSSSSRRRRMMMMNNNNSSSSVVILEEEELLLMTTTTEEEPEEQAEEQVRRRRNNQQGGERVVVVLLLIEEDEEEEEAAAAVVTKRRRTAAAAFFFFEEELLLFLNNNNIIIIQQPQVVVLFFFFDEDEGGDELLLLQQQQMMKELLMLLALLSSSTVVIHTTTDEEETNN.KEE.DLL.Q.S.P.S.R.A.P.G.L.RQKEQTTARCCSASSSSTTENHHKKSSGVTTNQPPDDVVASNNAATTSPLLKVQQTEIILTPPSPKRKR.G.K.P.P.LTATNIIFTIISRKK.STTSQTTSAPPPPLLVLLLLLRRQRMMFWVVAVLLLLGGGTLLVLLFGSVVIFAATLLLLVAVAATTTTVVVVSSGAMVMVGGGGIIVLYYYYAAAAFFFM.90908784179179176174255255248264278278271287梭鲈 Sander lucioperca河鲈 Perca uviatilis鲤 Cyprinus carpio智人 Homo sapiens 梭鲈 Sander lucioperca河鲈 Perca uviatilis鲤 Cyprinus carpio智人 Homo sapiens 梭鲈 Sander lucioperca河鲈 Perca uviatilis鲤 Cyprinus carpio智人 Homo sapiens 梭鲈 Sander lucioperca河鲈 Perca uviatilis鲤 Cyprinus carpio智人 Homo sapiens 深蓝色区域表示完全相似，黄色区域表示部分相似；下划虚线表示跨膜结构域(256278)；下划实线表示Pfam 功能结构域(17221)；矩形框表示细胞膜外氨基酸残基。Dark blue areas indicate complete similarity and yellow areas indicate partial similarity;transmembrane domain(256278)is highlighted by dotted line;Pfam functional domain(17221)is highlighted by underlines;extracellular amino acid residues aremarked with rectangular frames.图4 梭鲈与其他物种HO1氨基酸同源性比对Fig.4 Multiple alignment of HO1 amino acid sequences between S.lucioperca and other species102南 方 水 产 科 学第 19 卷肝中 ho1 无显著性变化(图 7-c、7-d、7-e)，3 h后表达量才开始升高，在低氧第 6、第 9 小时均显著高于正常水平；复氧后均呈现出降低-升高-降低的变化趋势，且极显著高于对照组(P0.05)，而肝 ho1 表达量直至复氧第12 小时也未恢复至正常状态，仍与对照组有极显著差异。梭鲈脑中 ho1 在低氧期间的相对表达量呈降低-升高-降低趋势(图 7-f)，胁迫第 3、第 9 小时的表达量均低于对照组，且差异显著(P0.05)。3 讨论 3.1 梭鲈 ho1 序列特征生物信息学分析目前对血红素加氧酶 1 的作用及其分子机制的研究已取得一定进展，但主要集中于肿瘤、癌症等人类疾病，近年来水产动物中的 HO1 研究也日益受到关注。本研究在梭鲈中克隆得到 ho1 的cDNA 序列，并进行生物信息学分析。梭鲈 ho1 全长 1 256 bp，包括 840 bp 的 ORF、162 bp 的 5-UTR 和 254 bp 的 3-UTR，共编码 279 个氨基酸，为亲水性不稳定蛋白。梭鲈 HO1 蛋白有一个Pfam 功能结构域，是血红素加氧酶家族共有的保守功能域19，也是 HO1 发挥其催化功能的区域；同时 HO1 蛋白的 N 末端有一个跨膜结构域，具有跨膜转运功能。有报道称，人 HO1 的 C 端被裂解后，可转移到细胞核内，参与由氧化应激介导的表达调控20，梭鲈 HO1 可能有着与之相似的功能。氨基酸序列比对发现，梭鲈与河鲈、鲤(Cyprinuscarpio)、智人(Homo sapiens)等不同物种的 HO1序列有较高相似度；系统发育进化树也表明梭鲈100100100941001001009310086756666100659795835144100586633黄金鲈 Perca avescens(XM_028596426.1)河鲈 Perca uviatilis(XM_039795744.1)梭鲈 Sander lucioperca(MZ553921)龙胆石斑鱼 Epinephelus lanceolatus(XM_033623278.1)尖吻鲈 Lates calcarifer(XM_018664976.1)金头鲷 Sparus aurata(XM_030429123.1)翘嘴鳜 Siniperca chuatsi(KJ765333.1)舌齿鲈 Dicentrarchus labrax(EF139130.1)条纹鲈 Morone saxatilis(XM_035659394.1)大菱鲆 Scophthalmus maximus(JX453446.1)荫平鲉 Sebastes umbrosus(XM_037763830.1)大口黑鲈 Micropterus salmoides