WS_T 647—2019 溶葡萄球菌酶和溶菌酶消毒剂卫生要求.pdf

ICS 11.080 C 59 WS 中华人民共和国卫生行业标准中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 6472019 溶葡萄球菌酶和溶菌酶消毒剂卫生要求 Hygienic requirement for lysostaphin and lysozyme disinfectants 2019-01-30 发布 2019-07-01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 I 目 次 前言.1 1 范围.2 2 规范性引用文件.2 3 术语和定义.2 4 原料要求.3 5 技术要求.3 6 应用范围.4 7 使用方法.4 8 运输、贮存和包装.5 9 标签、标志和说明书.5 10 检验方法.5 附录 A（规范性附录）溶葡萄球菌酶酶活性测定.7 附录 B（规范性附录）溶菌酶酶活性测定.9 附录 C（资料性附录）溶葡萄球菌酶色源底物制备.11 WS/T 6472019 1 前 言 本部分按照 GB/T1.12009 给出的规则起草。本部分起草单位：上海市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、复旦大学。本部分主要起草人：田靓、朱仁义、袁政安、沈伟、沈瑾、邱侠、陆婉英、黄青山、李国栋、陆晔、赵晓蔚、黄晋江、吴宏宇。WS/T 6472019 2 溶葡萄球菌酶和溶菌酶消毒剂卫生要求 1 范围 本标准规定了溶葡萄球菌酶和溶菌酶消毒剂的原料要求、技术要求、应用范围、使用方法、运输贮存和包装、标签标志和说明书、检验方法。本部分适用于以溶葡萄球菌酶和（或）溶菌酶为主要杀菌成分的酶类消毒剂。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 191 包装储运图示标志 GB 27950 手消毒剂卫生要求 GB 27951 皮肤消毒剂卫生要求 GB 27954 黏膜消毒剂卫生要求 中华人民共和国药典（2015年版）消毒技术规范（2002年版）卫生部（卫法监发2002282号）消毒产品标签说明书管理规范 卫生部（卫监督发2005426号）3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 酶类消毒剂 enzyme disinfectant 以酶为主要杀菌成分的消毒剂。3.2 溶葡萄球菌酶 lysostaphin 能水解细菌细胞壁肽聚糖中的甘氨酸肽键，使细菌死亡的酶。3.3 溶菌酶 lysozyme 能水解细菌中黏多糖的酶。亦称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。3.4 酶活性单位 enzyme activity unit 酶活性的度量单位。1个酶活性单位指在特定条件下，在单位时间内转化单位底物（或转化底物中单位有关基团）的酶量。WS/T 6472019 3 4 原料要求 4.1 溶葡萄球菌酶 白色或微黄色粉末，无臭、易溶于水；按干燥品计算，酶活性单位应100 U/mg。4.2 溶菌酶 符合国家药品标准中溶菌酶的要求。4.3 生产用水 符合中华人民共和国药典（2015年版）中纯化水的要求。4.4 其他原料 为食品级或化学纯或符合药典规定的原料，符合国家有关规定，不得使用工业级。4.5 禁用物质 不应含有抗生素、抗真菌药物、激素以及国家规定的其他禁用物质。5 技术要求 5.1 外观 不分层、无沉淀和悬浮物、无异味。5.2 理化指标 5.2.1 pH 值 pH值为5.08.0。5.2.2 有效含量 消毒剂中溶葡萄球菌酶的活性范围为0.5 U/mL20 U/mL，溶菌酶的活性范围为10000 U/mL200000 U/mL。产品有效成分含量在设定值或标示中心值的80%150%之内。5.2.3 稳定性 12个月。5.3 杀灭微生物指标 作用浓度和时间按产品标签说明书的要求，杀灭微生物指标应符合表1要求。用于手消毒应符合GB 27950的要求；用于皮肤消毒应符合GB 27951的要求；用于黏膜消毒应符合GB 27954的要求。WS/T 6472019 4 表1 杀灭微生物指标 项目 杀灭对数值 悬液法 载体法 大肠杆菌（8099）5.00 3.00 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）5.00 3.00 铜绿假单胞菌（ATCC 15442）5.00 3.00 白色念珠菌（ATCC 10231）4.00 3.00 自然菌（现场试验a）1.00 a用于手消毒做手现场试验，用于皮肤或黏膜消毒做皮肤现场试验。6 应用范围 适用于手、皮肤和黏膜的消毒。按产品说明书并有实验依据的产品可增加其他应用范围。7 使用方法 7.1 手消毒 7.1.1 卫生手消毒 取适量消毒剂于手心，双手互搓使均匀涂布每个部位，作用时间符合GB 27950的要求。7.1.2 外科手消毒 外科洗手后，取适量消毒剂均匀涂布于双手、前臂和上臂下1/3的皮肤，作用时间符合GB 27950的要求。7.2 皮肤消毒 7.2.1 完整皮肤 取消毒剂原液，或将消毒剂原液用符合中华人民共和国药典（2015年版）的纯化水或无菌水稀释至说明书规定浓度，均匀喷雾或用医用棉拭子擦拭皮肤表面，作用时间应符合GB 27951的要求。7.2.2 破损皮肤 从原包装倒出后一次性使用。取消毒剂原液，或将消毒剂原液用符合中华人民共和国药典（2015年版）的无菌水稀释至说明书规定浓度，冲洗破损皮肤表面，作用时间应符合GB 27951的要求。7.3 黏膜消毒 7.3.1 口腔黏膜 从原包装倒出后一次性使用。用消毒剂原液，或将消毒剂原液用符合中华人民共和国药典（2015年版）的纯化水或无菌水稀释至说明书规定浓度，均匀喷雾或用医用棉拭子擦拭或含漱，作用时间按照说明书，最长作用时间5 min。WS/T 6472019 5 7.3.2 阴道和外生殖器黏膜 从原包装倒出后一次性使用。用消毒剂原液，或将消毒剂原液用符合中华人民共和国药典（2015年版）的纯化水或无菌水稀释至说明书规定浓度，用医用棉拭子擦拭或灌洗或冲洗，作用时间按照说明书，最长作用时间5 min。8 运输、贮存和包装 8.1 运输 运输产品时应避免日晒、雨淋。不可与有异味或影响产品质量的物品混装运输。8.2 贮存 室温或阴凉处保存，避光、密闭、干燥，不可与有异味或影响产品质量的物品同处贮存。8.3 包装 产品的包装无毒和清洁，包装材质符合相应材料的化妆品包装要求。产品的包装密封，能保证产品的稳定性以及在储存运输、使用过程中的安全性。包装储运图示标志应符合GBT l91要求。9 标识要求 9.1 标签和说明书 符合消毒产品标签说明书管理规范 9.2 注意事项 说明书至少包括以下内容：避免接触拮抗物。不能与阴离子表面活性剂、Ba2+、Ca2+、Mg2+等同时使用。置于儿童不易触及处。对蛋白质过敏者慎用。10 检验方法 10.1 外观 用肉眼观察其色泽、形态，用嗅觉鉴别其气味。10.2 pH 值测定 按消毒技术规范（2002年版）规定方法测定。10.3 有效含量测定 10.3.1 溶葡萄球菌酶活性测定 按照附录A规定方法测定。10.3.2 溶菌酶活性测定 WS/T 6472019 6 按照附录B规定方法测定。10.4 稳定性测定 按消毒技术规范（2002年版）的方法，用微生物法进行稳定性实验。有效期24个月，用自然留样法测定；有效期为24个月，根据产品性能，选用37 存放90 d的方法，或用自然留样法测定。在有效期内，有效成分含量不得低于标示量的下限值。10.5 杀灭微生物试验 按消毒技术规范（2002年版有关规定测定。宜采用悬液法；若选用载体法时，应采用非吸附性材料（金属、玻璃、猪皮等）做载体。WS/T 6472019 7 A A 附 录 A（规范性附录）溶葡萄球菌酶酶活性测定 A.1 原理 以偶联活性艳蓝染料KNR的金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖（KNR-PG）为色源底物，根据酶作用过程中定量地释放带有KNR染料基团的小分子可溶性片段产物，在除去未反应的不溶性底物后，对上清液进行比色测定溶葡萄球菌酶酶活性。在pH 10.0的1.2 mL反应体系下，37温度下，在波长595 nm处，每分钟使KNR-PG溶液吸光度值增加0.35的酶量为1个溶葡萄球菌酶酶活性单位。A.2 试剂 A.2.1 溶葡萄球菌酶标准品溶液：按照溶葡萄球菌酶活性单位定义，对溶葡萄球菌酶冻干粉进行标定。需要时，用Tris-HCl缓冲液溶解，配制成0.9 U/mL的标准品溶液，-20 贮存，每次试验用1支，避免反复冻融。A.2.2 甘氨酸：分析纯。A.2.3 氢氧化钠：分析纯。A.2.4 三羟甲基氨基甲烷（Tris）：分析纯。A.2.5 95%乙醇：分析纯。A.2.6 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液：0.2 mol/L，pH 10.0。A.2.7 三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（Tris-HCl缓冲液）：0.05 mol/L，pH 7.5。A.2.8 色源底物KNR-PG溶液：按照附录C方法制备色源底物KNR-PG，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液以1:5质量体积比例均匀悬浮。A.3 试验步骤 A.3.1 标准曲线的制备 取洁净干燥的微量离心管6只，标号，按表A.1顺序每管中加入对应量的溶葡萄球菌酶标准品溶液（A.2.1），再加入不同量的0.2 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（A.2.6）。然后按序号加入色源底物KNR-PG溶液（A.2.8）130L，每管加入底物后迅速在旋涡混合仪上混匀。将加好溶液的微量离心管迅速移入37 的恒温水浴锅中定时反应20 min。从水浴中取出微量离心管，每管中加入300 L95%乙醇终止反应，10000 r/min离心10 min，离心结束后，取上清液于595 nm处，以0号管为空白测定吸光度。根据测得的吸光度值及相对应的标准品溶葡萄球菌酶酶活性（U/mL），求得线性回归曲线：C0=（A-B）/K（A.1）式中：C0标准品溶葡萄球菌酶酶活性（U/mL）；A吸光度；B截距；K标准曲线的斜率。WS/T 6472019 8 表A.1 标准曲线制备 管号 0 1 2 3 4 5 溶葡萄球菌酶标准品溶液/L 0 20 40 60 80 100 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液/L 770 750 730 710 690 670 底物/L 130 130 130 130 130 130 95%乙醇/L 300 300 300 300 300 300 溶葡萄球菌酶标准品溶液终浓度/U/mL 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 A.3.2 样品的测定 待测样品的测定方法同标准曲线，取50 L用于测定。平行测定3次，计算平均值。A.4 结果计算 根据标准曲线，计算未知溶液中溶葡萄球菌酶酶活性，见下式：C=C0 V反/V样 N（A.2）式中：C样品溶葡萄球菌酶酶活性（U/mL）；C0标准品溶葡萄球菌酶酶活性（U/mL）；V反反应体系体积，为0.9 mL；V样样品加入体积，为0.05 mL；N样品稀释倍数。WS/T 6472019 9 附 录 B（规范性附录）溶菌酶酶活性测定 B.1 原理 溶菌酶通过溶解革兰阳性菌细胞壁使细菌溶解，菌液在可见光范围内的吸光度降低，以溶壁微球菌为底物，用分光光度法，以450 nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度测定溶菌酶酶活性。在室温25、pH为6.2时，在波长450 nm处，每分钟引起吸收度下降0.001为1个溶菌酶酶活性单位。B.2 试剂 B.2.1 磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠10.4 g与磷酸氢二钠7.86 g及乙二胺四乙酸二钠0.37 g，加水溶解至1000 mL，调节pH至6.2。B.2.2 溶壁微球菌Micrococcuslysodeik，CGMCC1.0634。B.3 试验步骤 B.3.1 样品溶液制备 量取样品，用磷酸盐缓冲液稀释成约1000 U/mL的溶液，稀释所用倍数记为N。B.3.2 底物悬浮液的制备 临用前配制。称取溶壁微球菌15 mg20 mg，加磷酸盐缓冲液0.5 mL1 mL，在研钵内研磨3 min，再加磷酸盐缓冲液适量，使总体积约为50 mL，悬浮液于25 0.1 在450 nm波长处测得的吸收度为0.70 0.05。B.3.3 样品测定 量取25 0.1 的底物悬浮液3 mL，置比色池中，在450 nm的波长处测定吸收度，作为0 s的读数A0，然后量取25 0.1 的供试品溶液0.15 mL（相当于溶菌酶7.5 g），加到比色池中，迅速混匀，用秒表计时，至60 s时再测定吸收度A；同时量取磷酸盐缓冲液0.15mL，同法操作，做为空白试验，测得0 s的读数A0及60 s的读数A。平行测定3次，计算平均值。B.4 结果计算 计算未知溶液中溶菌酶酶活性，见下式：C0.15A-A-A-A00）（）（N 103（B.1）式中：C样品溶菌酶酶活性（U/mL）；A0 样品0s时的吸收度；A 样品60s时的吸收度；A0空白0s时的吸收度；A 空白60s时的吸收度；N 稀释倍数。WS/T 6472019 10 附 录 C（规范性附录）溶葡萄球菌酶色源底物制备 C.1 试剂 C.1.1 三氯乙酸（TCA）10%TCA：取三氯乙酸10 g，溶解于100mL纯水中。5%TCA：取三氯乙酸5 g，溶解于100mL纯水中。C.1.2 0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（Tris-HCl）取三羟甲基氨基甲烷6.0g，加水800mL溶解，用盐酸调节pH至7.5后，用水稀释至1000mL。C.1.3 0.25mol/L 氢氧化钠溶液 取氢氧化钠10.0g，加水1000mL溶解。C.1.4 其他试剂 金黄色葡萄球菌、生理盐水、胰蛋白酶、艳蓝染料（KNR染料）、叠氮钠、纯水。C.2 制备方法 C.2.1 按照消毒技术规范（2002年版）有关规定制备金黄色葡萄球菌悬液。C.2.2 对菌悬液121 20min灭菌后进行离心，收集菌体。C.2.3 菌体沉淀用生理盐水离心洗涤2次。C.2.4 用7倍菌体质量的10%TCA溶液悬浮菌体，4放置72h。C.2.5 离心，将菌体用生理盐水离心洗涤一次。C.2.6 用5倍菌体质量的5%TCA溶液悬浮菌体，90水浴10min。C.2.7 离心收集沉淀，生理盐水离心洗涤3次。C.2.8 用5倍菌体质量的Tris-HCl悬浮菌体，按0.5mg/mL浓度加入胰蛋白酶，置于37水浴24h。C.2.9 菌体于90水浴10min，灭活胰蛋白酶。C.2.10 离心收集沉淀，用纯水离心洗涤3次。C.2.11 用少量纯水悬浮菌体，于4下对纯水透析24h。C.2.12 离心，收集沉淀。C.2.13 按7倍菌体质量，配制0.25N的氢氧化钠溶液适量。C.2.14 用配制好的0.25N的氢氧化钠溶液的一半体积悬浮菌体。C.2.15 按1/7的菌体质量称取KNR染料，用剩余的氢氧化钠溶液进行溶解。C.2.16 在悬浮的菌液中加入配制好的染料，37水浴24h。C.2.17 离心，纯水洗涤至上清液无色，用少量纯水悬浮菌体，转移至保存容器内，按10mg/L浓度加入叠氮钠，4保存。_