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小鼠肝脏再生早期胆酸代谢相关基因SHP和Cyp7A1的动态改变
【摘要】 目的探讨小鼠肝脏70%切除术后再生早期,核受体SHP参与调控Cyp7A1基因表达的机制。方法应用逆转录实时定量PCR检测野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏70%切除术后1 h和6 h Cyp7A1基因和SHP基因的表达。结果2组肝脏Cyp7A1基因表达在术后1 h和6 h明显降低;SHP基因表达在术后1 h显着上升,术后6 h急剧下降。结论小鼠肝脏70%切除术后再生早期,非依赖FXR的通路参与胆酸介导的Cyp7A1基因转录的抑制。SHP可通过非FXR介导的途径参与调节Cyp7A1基因的表达。
【关键词】 肝再生 基因表达 胆固醇7α羟化酶 法尼醇 疾病模型 动物
小异二聚体伴侣(small heterodimer partner,SHP)是一种特殊的核受体,它没有DNA结合域,主要表达在肝脏。SHP通过与其他核受体家族成员的相互作用,抑制核受体介导的转录活性[1]。保持胆酸代谢平衡是维持小鼠肝脏正常再生所必需的重要条件。Cyp7A1基因编码经典胆酸合成途径中的限速酶胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7αhydroxylase,Cyp7A1),其调控主要在转录水平。当核受体法呢醇Ⅹ受体(farnesoid Ⅹ receptor,FXR)被胆酸激活后,FXR上调SHP的表达,SHP继而与核受体肝脏相关同系物(liver related homologue,LRH)结合,抑制LRH转录激活Cyp7A1基因的功能。FXRSHPLRH参与的通路是胆酸介导的反馈抑制Cyp7A1基因表达的重要途径。笔者以小鼠肝脏70%切除为动物模型,探讨肝脏再生的急性期,SHP是否通过上述途径参与调控Cyp7A1基因的表达。
1材料与方法
动物野生型小鼠C57BL/6NCr(美国National Cancer Institute),FXR基因敲除(FXR-/-)小鼠(美国Baylor医学院)。
试剂TRI试剂、溴氯丙烷(美国Molecular Research Center公司),异丙醇、二乙基焦磷酰胺(美国Sigma公司),MMLV逆转录酶(美国Invitrogen公司),重组核糖核酸酶抑制剂(美国Promega公司),SYBRGreen PCR Master Mix(美国Applied Biosystems公司)。
仪器匀浆器(PTMR2100，美国Lyophiler/polytron公司),低温离心机(CS6R，美国Beckman公司),分光光度计(640B，美国Beckman公司),实时定量PCR系统(7300SYBRGreen，美国Applied Biosystems公司)。
方法
模型制备野生型小鼠和FXR基因敲除(FXR-/-)小鼠均以C57BL/6 NCr为杂交背景。以12∶12 h昼夜交替作息。标准鼠类食物喂养,饮水不限。选择8~10周雄性小鼠，每组12只。行70%肝脏切除术小鼠肝脏左外叶、尾叶和中叶完全切除，保持胆囊完整。术后1 h、6 h分别处死小鼠，收取肝脏,液氮速冻后保存在-80 ℃冰箱。
肝脏总RNA抽提和cDNA合成取肝组织100 mg,在TRI试剂中匀浆,根据试剂盒方法抽提RNA。取RNA 3 μg,以OligodT为引物,在反应体系20 μL 65 ℃预变性10 min后,加入5×FS缓冲液, mol/L DTT,25 mmol/L dNTP,Rnasin和MMLV至反应体系30 min,42 ℃ 1 h。
实时定量PCR应用快速实时定量PCR系统定量检测肝脏中CYP7A1和SHP mRNA表达。使用的正向引物(F)和反向引物(R)包括:
CYP7A1(F):CAAGAACCTGTACATGAGGGAC
CYP7A1(R):CACTTCTTCAGAGGCTGCTTTC
SHP(F):GTCTTTCTGGAGCCTTGAGCTG
SHP(R):GTAGAGGCCATGAGGAGGATTC
βactin作为内对照。
统计学处理使用twotailed Student‘s t test进行统计学分析。
　　2结果
小鼠肝脏70%切除术后1 h和6 h,野生型小鼠和FXR/小鼠肝脏Cyp7A1基因表达均明显降低(图1)。
A:野生型小鼠; B:FXR-/-小鼠.
图170%肝脏切除术后再生早期野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏Cyp7A1基因表达
肝脏70%切除术后1 h,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏SHP基因表达均明显上升(图2)。
A:野生型小鼠; B:FXR-/-小鼠.
图270%肝脏切除术后1 h,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏SHP基因表达
Fig 2SHP gene expression in the liver of wild type and FXR-/- mice at one hour after 70%hepatectomy
肝脏70%切除术后1 h和6 h,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏中SHP基因的表达均显着下降(图3)。
3讨论
小鼠肝脏70 %切除术后再生早期非依赖FXR通路参与抑制胆酸介导Cyp7A1基因转录肝脏再生过程由许多有机结合的阶段构成,在这个过程中许多信号通路被激活。胆酸主要在肝脏内由胆固醇转变而来，除了促进脂类食物的吸收,胆酸还是信号分子,其功能类似于激素。最近有研究显示小鼠肝脏的正常再生必需有胆酸信号的存在。70%肝脏切除术后所致胆酸堆积不仅促使肝脏通过再生来减轻胆酸的负荷,而且通过抑制Cyp7A1基因表达减少胆酸的合成。
胆酸可通过多种机制反馈抑制Cyp7A1基因表达。胆酸介导的FXRSHPLRH1级联反应是Cyp7A1基因转录抑制的重要方式。笔者对野生型小鼠和FXR-/-小鼠行70%肝脏切除术,发现术后1 h和6 h,两组小鼠肝脏Cyp7A1基因表达均明显降低，提示在肝脏再生早期,非依赖FXR通路参与抑制胆酸介导的Cyp7A1基因表达。
小鼠肝脏70%切除术后再生急性期SHP可通过非FXR介导途径参与调节Cyp7A1基因表达SHP是核受体超家族的非典型成员,没有DNA结合区域，它可介导许多核受体包括LRH1功能的失活[1]。本研究显示，在70%肝脏切除术后1 h,野生型和FXR-/-小鼠的肝脏SHP mRNA水平都显着性升高，提示在肝脏再生急性期,SHP可通过非FXR介导通路参与调节Cyp7A1基因表达。cJun N端激酶的激活是部分肝脏切除术后肝脏再生的早期事件。在小鼠SHP启动子上存在相邻近的两个反应元件——IR1和AP1，胆酸信号激活FXR和JNK通路的成员cjun后,分别通过与IR1和AP1结合促进SHP转录。因此在肝脏再生急性期,SHP可能通过JNK介导的通路抑制Cyp7A1基因转录，以使肝脏快速适应突然增高的胆酸水平。
可通过自我负反馈机制抑制自身的表达笔者发现，术后6 h野生型和FXR-/-小鼠肝脏SHP mRNA水平均明显下降，可能的原因是之前大量诱导的SHP mRNA表达导致了SHP自身的负反馈抑制。因为SHP的启动子上具有LRH1结合位点,SHP通过与LRH1相互作用抑制自身表达。由于SHP是许多核受体的抑制物,SHP自我负反馈调节机制可以防止因胆酸信号诱导的SHP过量表达所致的SHP靶基因的不当抑制[3,8]。
在肝脏70%切除术后正常再生过程的不同阶段,胆酸信号可能通过不同的分子机制抑制Cyp7A1基因转录。在再生急性期,胆酸水平显着升高,SHP可通过非FXR介导途径参与快速抑制Cyp7A1基因表达。在肝脏再生晚期,随着肝脏体积增大,肝脏功能逐渐恢复,胆酸负荷减轻,Cyp7A1基因表达的调控可能主要通过依赖FXR和SHP途径实现。FXRSHPLRH1通路对胆酸介导的Cyp7A1基因转录的抑制呈现起效慢、持续久的特征。在肝脏再生的不同阶段,胆酸信号通过激活不同通路反馈抑制Cyp7A1基因转录，这些通路协调合作组成一个精密的调控网络,对胆酸信号的改变做出及时反应。
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