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人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定【摘要】 目的：利用基因工程技术克隆TRAIL基因全长cDNA，并构建其原核表达载体. 方法：从人胎盘中提取总RNA，利用RTPCR技术扩增了TRAIL，将其连接于克隆载体pMD18T中，并通过酶切及测序鉴定载体构建的正确性. 结果：应用RTPCR技术和BamH和EcoR双酶切成功获得1049 bp的目的片段，测序分析结果表明该基因序列与报道的TRAIL基因片段的序列完全相同. 结论：成功克隆了TRAIL基因的cDNA全长，为其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.【关键词】 肿瘤坏死因子;细胞凋亡;配体；RTPCR；序列测定；人胎盘 0引言 1995年Wiley和Pitt首次从人的表达标签文库中发现一个与肿瘤坏死因子家族基因序列具有高度同源性的DNA克隆，其表达的蛋白具有诱导细胞凋亡的功能，因而将其命名为肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体1-2. 作为一种新的凋亡诱导配体，肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)自发现以来，就一直倍受关注. 有关TRAIL和TRAIL受体以及其信号转导通路的研究己取得很大进展，而TRAIL特异性诱导肿瘤细胞凋亡的分子调控机制目前尚未阐明. 作为一种特异性诱导肿瘤细胞凋亡且无明显毒副作用的分子，TRAIL极有可能成为新的抗肿瘤制剂3-4. 研究表明，TRAIL在选择性诱导肿瘤细胞凋亡的同时对正常组织没有明显细胞毒性，并且和放、化疗有协同作用，使得TRAIL在肿瘤的治疗上具有广阔的前景5-6. 我们采用RTPCR方法克隆了TRAIL全长的基因片段，经酶切和测序证实其正确性，为进一步研究及临床应用奠定基础. 1材料和方法 材料大肠杆菌DH5由第四军医大学西京医院妇产科实验室保存，pMD18T载体、EcoRI, BamHI内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000购自大连TaKaRa公司，胰蛋白胨，酵母提取物购自英国OXOID LTD公司，质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司，PCR引物由上海博亚生物工程有限公司合成. 方法 引物的设计与合成根据GenBank报道的TRAIL基因的序列并参照已发表的文献设计合成两条引物. 上游引物P1序列为: 5GAATTCcggctgcctggctgacttac3，划线处为EcoR的酶切位点；下游引物P2序列为: 5GGATCCtttttggttgtggctgctctac3，划线处为BamH的酶切位点. 胎盘组织中总RNA提取采用Trizol一步法提取人胎盘组织中总RNA. 称取100 mg新鲜人胎盘组织，加入1 mL Trizol匀浆，裂解5 min. 加入氯仿进行液相分离. 取上层水相，转至另一离心管中. 加异丙醇沉淀，离心10 min后弃上清，RNA沉淀于管底. 加700 mL/L乙醇洗涤，温和震荡离心管，悬浮沉淀. 再次离心5 min；尽量弃上清；37干燥后，溶于DEPC水中. 取其中2 L溶液紫外分光光度计定量，其余贮存于-80待用. PCR取5 L总RNA，按Fermentas试剂盒的说明进行操作. 扩增参数为：70水浴5 min，37水浴5 min，42水浴60 min， 70水浴15 min，冰浴，待用. 然后以cDNA为模板，PCR反应条件为：95变性3 min后，按94 30 s，55 30 s，72 1 min的顺序循环30次，再于72延伸7 min. 取PCR产物5 L在含溴化乙啶的10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳. 产物的纯化、克隆与鉴定PCR扩增产物电泳结束后，在紫外检测仪下切取所需大小的凝胶片段，按凝胶回收试剂盒操作说明第一次回收目的片断. 将回收产物用EcoRI和BamH内切酶进行双酶切第二次回收目的凝胶片段，酶切产物在含溴化乙啶的10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，缓冲液为TBE，电泳结束后，在紫外检测仪下切取目标片段，第三次回收. 取凝胶回收纯化的PCR产物4 L加入pMD18T载体1 L, Ligation Solution 5 L, 16连接过夜. 连接产物转化感受态细菌DH5,然后将连接产物涂布于含100 g/mL氨苄青霉素的固体LB培养基平板中,37培养过夜. 挑取单菌落加入5 mL含100 g/mL氨苄青霉素的液体LB培养基试管中,37培养过夜. 采用质粒抽提试剂盒进行质粒抽提,对质粒进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定,鉴定阳性的载体送大连TAKARA公司测序. 将测序证实完全正确的序列命名为pMD18TTRAIL,保存菌种. 2结果 基因的克隆提取胎盘组织总RNA，反转录合成cDNA第一链，以此为模板进行PCR, PCR产物的大小约为1049 bp (图1)，无杂带、特异性良好,与我们所设计的相吻合，克隆后片段大小与PCR产物大小吻合. 基因重组载体的酶切鉴定用Bam H和EcoR双酶切含有TRAIL基因的pMD18T载体，获得大小为1049 bp的目的片段(图2)，表明含有TRAIL基因的克隆载体构建成功. 基因的序列分析以定向克隆入pMD18T载体中的TRAIL基因的PCR产物转化 DH5, 挑取均含有目的基因片段的5个菌落，取其中1个菌落做序列测定证实，所得序列的结果联网到NCBI进行同源性分析. 核酸序列与质粒pMD18TTRAIL中的TRAIL序列同源性为%，发现有两个碱基突变. 在NCBI的ORF finder中， 服务器分析开放阅读框架， 翻译成281个氨基酸序列， 进行同源性分析， 同源性为100%. 说明测序结果中的两个碱基突变为同义突变， 外源TRAIL基因可以正确表达. 3讨论 TRAIL为肿瘤坏死因子(TNF)超家族的新成员. 人的TRAIL基因编码一种Mr 32 500的II型跨膜蛋白，该蛋白由281个氨基酸残基组成. 其氨基端位于胞外区，可形成同源二聚体与相应的膜受体结合，介导信号转导入细胞内，引起细胞凋亡. 研究发现，TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡主要通过与其受体结合发挥作用. 随着研究的深入, 后来相继发现了与TRAIL结合的受体共有5种，它们的功能也渐趋清楚7-8. 其5种受体为：两种死亡受体即DR4 (death receptor 4)和DR5 (death receptor 5)；两种诱骗受体即DcR1 (decoy receptor l)和DcR2 (decoy receptor 2)；一种可溶性受体骨保护素(osteoprotegerin, OPG)，是调节骨密度有关的受体(regu1ating bone density receptor). DR4和DR5具有TNF受体超家族其它成员类似的胞浆死亡结构域(plasmic death domain)，其与TRAIL特异结合后可通过死亡结构域激发和传导细胞凋亡信号，激活caspase蛋白酶解级联反应，导致细胞死亡9-10. 肿瘤治疗一直是治疗性细胞凋亡干预的重要应用领域. TNF和FasL或Fas单克隆抗体很早就被用于肿瘤的治疗. 它们在体外都能诱导肿瘤细胞迅速凋亡，有效杀伤肿瘤细胞，但皆因严重的毒副作用，其中主要是对机体正常细胞的杀伤作用，限制了它们的临床应用. TRAIL能有效杀伤肿瘤细胞，但其mRNA在组织中的广泛分布提示它对正常组织细胞可能没有毒性. 研究提示，正常组织细胞因具有TRAIL诱骗受体(decoy recptor)，能逃避TRAIL的攻击，而肿瘤细胞不具有这一保护性受体，不能抵御TRAIL的杀伤作用11. 由于TRAIL诱导凋亡机制不同于TNF，因此对其抗肿瘤作用价值的评价就显得十分重要. 【参考文献】 1 Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, et al. Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosisJ. Immunity, 1995, 3(6):673-682. 2 Pitti RM, Marsters SA, Rupppert S, et al. Induction of apoptosis by Apo2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cyokine familyJ. J Biol Chem, 1996, 271(22): 12687-12690.3 Gruss HJ. Molecular structyral and biological characteristics of the tumor necrosis factor ligand superfamilyJ. Int J Clin Lab Res, 1996, 26(3): 143-159.4 Shi J, Zheng D, Man K, et al. TRAIL: A potential agent for cancer therapy J. Curr Mol Med, 2003, 3(8):727-736.5 Wu XX, Ogawa O, Kakehi Y, et al. TRAIL and chemotherapeutic drugs in cancer therapyJ. Vitam Horm, 2004, 67:365-383.6 Tomek S, Horak P, PribllI, et al. Resistance to TRAILinduced apoptosis in ovarian cancer cell lines is overcome by cotreatment with cytotoxic drugsJ. Gynecol Oncol, 2004, 94(1): 107-114.7 Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biologyJ. Cell, 2001, 104(4): 487-501.8 Emery JG, McDonnell P, Burke MB, et al. Osteoprotegerin is a receptor for the cytotoxic ligand TRAILJ. J Biol Chem, 1998, 273(23):14363-14367.9 Kischkel FC, Lawrence DA, Chuntharapai A, et al. Apo2L/TRAILdependent recruitment of endogenous FADD and caspase8 to death receptors 4 and 5J. Immunity, 2000, 12(6): 611-620.10 Sprick MR, Weigand MA, Rieser E, et al. FADD/MORT1 and caspase8 are recruited to TRAIL receptors 1 and 2 and are essential for apoptosis mediated by TRAIL receptor 2J.Immunity, 2000, 12(6):599-609.11 Sheridan JP, Marster SA, Pitti RM, et al. Control of TRAILinduced apoptosis by a family of signaling and decoy receptorJ. Science, 1997, 277(5327): 818-821.