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混合系白血病基因重排的检测方法及其临床意义【摘要】 为了研究混合系白血病基因重排在急性白血病(AL)中的发生率、融合基因类型及其临床意义，用荧光原位杂交技术检测60例急性白血病患者MLL基因重排，对于MLL基因重排阳性的患者，用巢式RTPCR方法检测MLL基因重排形成的6种常见融合基因类型。结果表明： 7例AL患者有MLL基因重排，发生率为%，其中2例为急性髓细胞白血病M5 ，融合基因均为MLLAF9 ；另5例为B细胞系急性淋巴细胞白血病，其中2例融合基因为MLLENL，1例MLLAF4，2例未扩增出融合基因产物。结论：荧光原位杂交技术是检测AL MLL基因易位重排的快速、特异、灵敏的方法，巢式RTPCR是检测MLL基因重排产生的融合基因类型的简便可行的方法；MLL基因重排的检测对急性白血病预后判断和治疗方案的选择具有重要意义。【关键词】 急性白血病 混合系白血病基因 基因重排 荧光原位杂交 巢式RTPCR Detection of Rearrangements of Mixed Lineage Leukemia Gene and Its Clinical Significance Abstract To study the incidence， the types of fusion genes and the clinical significance of rearrangements of mixed lineage leukemia (MLL) gene in acute leukemia (AL), the rearrangements of MLL gene of 60 patients with AL were detected by fluorescence in situ hybridization (FISH) and 6 types of common fusion genes resulting from the rearrangements of MLL gene were detected by nested RTPCR. The results showed that 7 out of 60 AL patients were found the rearrangements of MLL gene, the incidence of which was %. 2 out of 7 patients were diagnosed as AMLM5， 5 patients were diagnosed as BALL. The fusion genes of the 2 AMLM5 patients who had the rearrangements of MLL gene were MLL/AF9. Among 5 BALL patients, 2 patients were confirmed to express MLL/ENL, 1 patient was confirmed to express MLL/AF4, the other 2 patints did not express the fusion genes. It is concluded that FISH is a fast, specific and sensitive method to detect the rearrangements of MLL gene in AL patients and nested RTPCR is a convenient and feasible method to detect the types of fusion genes resulting from the rearrangements of MLL gene. The detection of MLL gene rearrangement is of great importance in predicting prognosis and guiding therapy in AL. Key words acute leukemia; mixed lineage leukemia gene; gene rearrangement；fluorescence in situ hybridization; nested RTPCR 混合系白血病(mixed lineage leukemia，MLL)基因位于染色体11q23。人类白血病包括初发和治疗相关性白血病,伴有MLL重排。Munoz等1报道,MLL重排阳性患者对常规化疗多不敏感，对大剂量化疗或干细胞移植有效，是预后不良的指标。世界卫生组织提出将其单列为11q23 /MLL白血病2。 因此，MLL基因重排的检测对急性白血病预后判断和治疗方案选择具有重要意义3。我们采用FISH 技术和巢式RTPCR方法对60例AL患者作了初步研究，探讨MLL基因重排在AL中的发生率、产生融合基因的类型及其临床意义。 材料和方法 研究对象 60例 AL 患者为我院血液科和深圳市其他医院血液科2003年9月-2005年12月的住院患者，男28例、女32例，年龄3个月-54岁，其中 15岁者17例，15岁者43例。所有患者的诊断符合FAB诊断标准。60例AL患者中急性淋巴细胞白血病(ALL)30例, AML 28例1例，NK细胞白血病1例。59例为初治患者，1例为难治患者。 细胞处理 对1例难治性AL患者采集肝素抗凝外周血2 ml，其余59例患者均于化疗前采集肝素抗凝骨髓2 ml，接种于培养瓶，经直接法或者经24小时培养，按标准方法制备染色体标本，用已制备好染色体标本的细胞悬液2-3滴滴片，自然凉于后用 mgL蛋白酶K室温消化3分钟，室温条件下在2SSC中洗涤2分钟，并分别于70、85、100 的乙醇中梯度脱水2分钟，凉干。 FISH检测 探针配制 7 l杂交液，再加2 l双蒸水加1 l MLL双色断裂分离重排探针，混匀后加5 l于玻片杂交区内，盖上盖玻片，橡胶水泥封片，于78热平台上变性3分钟后置37湿盒中避光杂交过夜，杂交后去盖玻片，采用快速洗涤法：73含的NP40的SSC(pH )中洗10秒，室温下在含%的NP40的2SSC(pH )中洗5秒，用含二咪基苯基吲哚(DAPI，浓度为 mgL)的抗褪色液复染标本10分钟后用荧光显微镜观察，每例至少分析200个细胞。 FISH结果判断标准 MLL基因易位重排阴性的细胞显示2个融合信号，MLL基因易位重排阳性的细胞中红色和绿色信号分离，显示1个融合信号和1个红色及1个绿色信号。 MLL融合基因表达的巢式RTPCR检测4 第一轮PCR 引物：均委托上海Sangon公司合成，序列A： MLL 5CCC AAA GAA AAG CAG TAG TGA 3；B： AF4 5TTT GTA GGG AAA GGA AAC TTG 3；C： AF6 5TTC CCG ATC ATC TTT GTT C 3；D： AF9 5GAT TTG CTT TGC TTT ATT G 3；E： AF10 5CTG TTC TAT GCT GGC TGC TA 3；F： AF10 5CTG GTT GAT CAT AGC GAA TC 3；G： ELL 5GCT TCC TTG AAA TCG GAT AG 3；H： ENL 5CGT ACC CCG ACT CCT CTA CT 3；I： ENL 5GCC TGA CAC CTT GCT GTT 3。 RNA提取：用TRIzoL提取细胞总RNA， 紫外分光光度计测定RNA纯度，同时进行RNA定量。 PCR：PCR反应分别在6个体系中进行,体系 1检测MLL/AF4 融合基因，上游引物用A，下游引物用B；体系2检测MLL/AF6 融合基因，上游引物用A，下游引物用C；体系 3检测融合基因MLL/AF10，上游引物用A，下游引物用E和F；体系4检测融合基因MLLENL，上游引物用A，下游引物用H 和I；体系 5检测融合基因MLL/AF9 ，上游引物用A，下游引物用D；体系6检测融合基因MLL/ELL，上游引物用A，下游引物用G。PCR反应体系50 l用一步法RTPCR试剂盒配制，含总RNA1 g，10RTPCR缓冲液5 l，25 mmol/L MgCl2 10 l，10 mmol/L dNTPs 5 l，40 U/l RNA酶抑制剂1 l，5 U/ l AMV逆转录酶1 l，5 U/l AMV Taq DNA多聚酶1l，特异引物各30 pmol，内参照上下游引物各16 pmol。扩增条件：50 30 分钟 RT反应，94 2分钟，逆转录酶灭活，(94 30秒，5630秒，72 1分钟)共30个循环，72延伸 5分钟。 第2轮PCR 引物序列：J： MLL 5CTC AGC CAC CTA CTA CAG GAC 3；K： AF4 5TTT GGT TTT GGG TTA CAG AAC 3；L： AF6 5GAT AAC CCC TTC TTT TTC CTG 3；M： AF9 5AGC GAG CAA AGA TCA AAA TC 3；N： AF10 5CCT GGA AAT TTG CAT TTG TAA 3；O： AF10 5TCT TCC AAG CGC TTC AAT 3；P： ELL 5CCG ATG TTG GAG AGG TAG AA 3；Q： ENL 5GGA CAA ACA CCA TCC AGT C 3 ；R： ENL 5GGC GCT GTT GTC ACT CTC 3。内参照2 MG 引物上游：5ACC CCC ACT AAA AAG ATG A 3，下游：5ATC TTC AAA CCT CCT AGA TG 3。 PCR：仍然在6各体系中进行，体系1检测MLL/AF4 融合基因，上游引物用J，下游引物用K；体系2检测MLL/AF6融合基因，上游引物用J，下游引物用L；体系3检测融合基因MLL/AF10 ，上游引物用J，下游引物用N 和O；体系4检测融合基因MLL/ENL，上游引物用J，下游引物用Q和R；体系5检测融合基因MLL/AF9 ，上游引物用J，下游引物用M；体系6 检测融合基因MLL/ELL，上游引物用J，下游引物用P。反应体系50 l含第1轮RTPCR产物1-2 l，10PCR 缓冲液5 l，25 mmol/L MgCl2 4 l，2 mmol/L dNTPs 5 l，2 U/l Taq DNA多聚酶 l，特异引物各30 pmol，内参照上下游引物各16 pmol。扩增条件：94 5分钟，(94 30秒，56 30秒，72 30秒)，共30个循环，72延伸5分钟。两轮PCR反应中每个体系均设阴性对照。 第2轮PCR产物检测： 取5 l 第2轮PCR产物在 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭(1 mg/L)染色，紫外线反射仪上观察、摄影，经凝胶图像分析系统分析电泳结果。 化疗方案及疗效判定 除急性早幼粒细胞白血病患者采用全反式维甲酸、砷剂及化疗交替治疗外，ALL和ANLL分别采用以VDLP和DA为主的方案化疗，观察1-3个疗程，疗效判定标准按血液病诊断及疗效标准第二版 5。 统计学处理 分类资料用四格表2检验。 结 果 FISH检测 正常分界值的确定如下6，将正常分界值设定为阴性对照组中所观察到的阳性细胞数的平均值+3个标准差(分界值 +3SD)。阴性对照组有15例患者，其中IDA 4例，ITP 6例，正常3例，炎症2例，均经骨髓细胞学检查确诊。FISH检测该组阳性细胞百分率为1%-3%，平均值为%，标准差为%，分界值=%+3%=%，将阳性细胞百分率大于该值的标本定性为MLL基因重排阳性。 MLL基因重排在急性白血病中的发生率 MLL基因易位重排阴性患者的骨髓细胞显示2个融合信号。在60例AL患者中，7例为MLL基因重排阳性的细胞中，红色和绿色信号分离，显示1个融合信号和1个红色及1个绿色信号。7例MLL基因重排阳性骨髓细胞中红色、绿色荧光信号分离的细胞比例分别是92%、15%、70%、90%、16%、86%、72%。60例AL患者中有7例为MLL基因重排阳性，发生率为%，其中ALL的发生率为% (4/29)，AML的发生率为% (2/28)，AML与ALL的MLL基因重排的发生率差异无显着性意义()。17例儿童AL中有2例具有MLL基因重排，发生率为，43例成人AL中有5例具有MLL基因重排，发生率为%，本研究中儿童与成人AL患者中MLL基因易位重排发生率差异无显着性意义()。 Figure 1. Nonrearrangements of MLL gene. All are fusion signal. Figure 2. Rearrangements of MLL gene. MLL融合基因类型RTPCR检测 本研究对7例MLL基因重排阳性患者分别用巢式RTPCR方法进行融合基因类型检测，主要检测常见的6种融合基因类型。巢式RTPCR检测结果见图3图6 。2例AMLM5患者的融合基因是t(9；11)(p21-22；q23) MLL/AF9，1例成人BALL患者的融合基因为t(4；11)(q21；q23)MLL/AF4，1例儿童及1例成人BALL患者的融合基因为t(11；19)(q23；)MLL/ENL，其余2例未扩增出融合基因产物。 临床结果 60例AL患者中，有44例进行了化疗，其中1个疗程达完全缓解者29例，2个疗程达CR者5例，3个疗程达CR者2例，未获CR者7例，1例未结束化疗。2例MLL基因重排阳性的ANLLM5患者中1例为初治，发病时左侧小腿有白血病细胞浸润，化疗1个疗程后获骨髓学完全缓解，1年以后发生中枢神经系统白血病。1例为化疗后未缓解的AL患者，于第3个疗程化疗后才达CR。5例MLL基因重排阳性的BALL患者中有1例于诊断后第2天因DIC脑出血死亡，未进行化疗；2例于诊断后3周内死于全身衰竭和感染，化疗后未获CR；1例发病时胸椎有白血病细胞浸润，1个疗程化疗后获CR，1例发病6天正在行VMP方案化疗。 讨 论 FISH的基本原理是标记了荧光的单链DNA和与其互补的DNA退火杂交, 通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况。由于本实验MLL双色断裂分离重排探针设计单位点是特异的，探针是双色标记，故特异性高，用FISH能够检测MLL基因重排。对MLL基因重排也可用DNA印迹法检测，但由于敏感性不够高，耗时长，放射性标记的探针对环境污染大，如果改用非放射性标记的探针，敏感性降低，故DNA印迹法不适于MLL基因重排的常规检测。Hee等6利用FISH检测20例非恶性血液病患者的MLL基因，假阳性率+ 3SD= %，Cuthbert等7FISH技术检测经细胞遗传学和DNA印迹法检测确定具有MLL基因重排的29例患者及4个细胞株，证实FISH的灵敏度为100%。这说明FISH 技术具有特异性高、能确定重排染色体的来源、灵敏度高的优点，同时还具有快速、直观、分辨率高的特点，因此可应用于MLL基因易位重排的常规检测。但是，此探针只能检测MLL基因易位重排，对于其他重排类型如缺失、倒位和重复则检测不到的。 巢式RTPCR不仅能检测MLL基因重排中的染色体易位形成的融合基因类型、部分串联重复，而且能同时检测到多种融合基因共同表达，是检测MLL基因重排产生的融合基因类型简便可行的方法。因此，巢式RTPCR和FISH联合应用是检测MLL重排的精确和灵敏的方法，也是确定MLL重排性质的重要手段。 MLL基因定位于染色体11q23。1lq23异常可涉及MLL、PLZF、RCK等基因，其中MLL基因最常见，其变异由缺失、倒位、重复或者易位所致，其中易位占86 。目前发现MLL基因易位重排类型有60多种，已鉴定的伙伴基因约30种，易位往往导致MLL基因与各种伙伴基因融合，其常见的融合基因有MLL/AF4, MLL/ENL，MLL/AF9，MLL/ELL，MLL/AF6，MLL/AF10 。鉴定每个具有MLL基因重排的AL患者的融合基因类型难度较大8，9，所以本研究只检测常见的6种融合基因类型。本实验显示，60例AL患者中有7例为MLL基因重排阳性，发生率为%，其中ALL的发生率为% (5/30)，AML的发生率为% (2/28)，与Strehl等10报道的MLL基因重排见于5-10 的儿童和成人的ALL和急性非淋巴细胞白血病一致。MLL基因重排白血病中ALL多为B细胞系，AML多为M5 。本研究初步提示，MLL基因重排在AL中较常见，但由于样本例数较少，尚不能揭示MLL基因易位重排在AL FAB分类各亚型中的发生率。MLL基因重排中染色体易位形成的融合基因为的MLL/AF9，MLL/AF4，MLL/ENL。有2例MLL基因易位重排阳性的患者未扩增出融合基因产物，可能的原因是其融合基因类型不属于上述6种融合基因或者融合基因类型是这6种融合基因之一，我们所设计的引物没有跨越这2例患者的融合基因mRNA剪接本的断裂点。 国外多个研究组证实，具有MLL重排的AL有其独特的临床、血液学和预后特点。如外周血白细胞计数高，器官浸润常见，易发生中枢神经系统白血病，常规化疗难以予以缓解，缓解后易复发，预后差，平均生存期短11 。本组7例MLL重排阳性患者中3例发病时有髓外浸润，1例予3个疗程化疗后才达CR，3例MLL重排阳性患者均于诊断后短期内死亡。这些结果提示，MLL基因重排阳性的AL患者疾病进展快，对常规化疗不敏感，预后差。应用FISH和巢式RTPCR检测急性白血病患者MLL基因重排，对急性白血病预后判断和治疗方案的选择具有重要意义。 【参考文献】 1Munoz L, Nomdedeu JF, Villamor N，et alAcute myelold leukemia with MLL rearrangements：clinicobiological features，prognostic impact and value of flow cytometry in the detection of residual leukemic cellsLeukemia, 2003; 17:76-82 2Cox MC, Panetta P, Venditti A, et al Fluorescence in situ hybridization and conventional cytogenetics for the diagnosis of 11 q23+MLL+ translocation in lenkaemia. 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