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固相合成法制备环肽Hymenistatin1及其含statine的类似物
【摘要】　目的 研究固相合成法制备Hymenistatin1［HS1，序列为cyclo(ProProTyrValProLeuIleIle)］及其statine类似物的工艺步骤和影响因素。方法 采用Fmoc或Boc保护α氨基，以HBTU/NMM为缩合剂进行直链肽接肽反应、以BOP/HOBt/DIEA为缩合剂进行环化固相合成HS1及其类似物。用色谱仪和质谱仪对合成的环肽及其杂聚肽类似物进行纯化鉴定。结果 多肽合成收率可达65%，经反相高效液相色谱(RPHPLC)柱对合成的多肽进行纯化后纯度均达到90%以上，通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪(MALDIMS)检测所合成的环肽及环肽类似物的分子质量与理论分子质量相符。结论 成功合成出了较高纯度的目标多肽化合物。
【关键词】　固相多肽合成； HS1； Statine类似物； 纯化
ABSTRACT Objective Preparation of Hymenistatin1 ［HS1, cyclo(ProProTyrValProLeuIleIle)］ and its four statineanalogues by solidphase peptide synthesis method, and the synthesis process and influencing factors were investigated. Methods Using the Fmoc or Boc protected αamino acids, HBTU/NMM as coupling reagent (linear peptide synthesis) and BOP/HOBt/DIEA as cyclizing reagent, the cyclooctapeptide HS1 and its analogues were synthesized. The target peptides were purified by RPHPLC and identified by MALDIMS. Results The purity of the five peptides exceeded 90% and the yields up to 65%. The molecular wghts of the synthesized peptides were identified by mass spectrogram. Conclusion The target peptide compounds with higher purity were synthesized.
KEY WORDS Solidphase Peptide Synthesis; HS1; Statineanalogues; Purification
Hymenistatin1(HS1)是由Pettit等［1］从太平洋Hymeniacidon海绵中分离得到的一种环八肽。肽链序列为：cyclo(ProProTyrValProLeuIleIle)。有报道称HS1在小鼠成淋巴细胞白血病P388的研究中具有抑制细胞生长的作用，但结果并没有在后续的研究中得到充分证实［2］。
Cebrat等［3］揭示了H1具有抑制体液和细胞免疫反应的免疫抑制作用。 Poojary等［4］合成的HS1显示出对细菌生长的抑制作用，但对真菌的抑制作用不强；HS1的驱虫作用不大，但表现出一定的抗炎症作用。Zubrzak等［5］用1，5二取代四唑环修饰HS1之后，修饰物的免疫抑制活性变化不大。
Statine是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCoA，胆固醇合成限速酶)的竞争性抑制剂，具有多种免疫调节作用和细胞效应，且不依赖于血液胆固醇的降低。 有研究表明， statine不但可以抑制IFNγ刺激诱导的人巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的MHCII抗原的表达［6］，还可以选择性阻断整合素β2、白细胞功能抗原1(LFA1，即CD11a/CD18)的表达［7］。这些功能与statine对HMGCoA的抑制作用无关，提示statine也是一种潜在的免疫抑制剂。天然HS1的生物学活性较弱，不能作为免疫抑制剂。本文研究拟采用statine对HS1进行修饰，以期能够有效提高HS1的免疫抑制活性。
天然HS1结构中的氨基酸残基都是疏水性氨基酸，并且是环状结构，致使化学合成极其困难。为此，本文还希望通过修饰降低HS1的疏水性，提高HS1在水溶液中的溶解性。下面报道HS1及4个新化合物的设计、固相合成与分离纯化方法。
　1 实验部分
　仪器与试剂
多肽合成仪(CS536，美国CSBio公司)，半制备型高效液相色谱仪(Waters Delta Prep4000，美国Waters公司)，分析型高效液相色谱仪(Agilent 1100，美国Agilent公司)，冷冻干燥机(Christ Alpha，德国Christ公司)，激光解吸电离飞行时间质谱仪(LCQ Deca，美国ThermoFinnigan公司)，紫外分光光度计(Beckman DU7400，美国Beckman公司)，C18反相分析柱(Sepax GPC18，5μm，120，×150mm)。
实验所用FmocProMerrifield Resin(取代值/g，交联度1%，100～200目)、BocValWang Resin(取代值/g，交联度1%，100～200目)、FmocProCTC Resin(取代值/g，交联度1%，100～200目)、BocTyr(tBu)OH、BocProOH、BocIleOH、BocLeuOH、FmocTyr(tBu)OH、FmocProOH、FmocIleOH、FmocLeuOH、Bocstatine(3s，4s)OH、HATU［O(7偶氮苯并三氮唑1氧)N，N，N′，N′四甲基脲六氟磷酸酯］、HBTU(苯并三唑1四甲基六氟磷酸酯)、HOBt(N羟基苯并三唑)、BOP(邻苯二甲酰丁辛酯)、DIEA(N，N二异丙基乙胺;二异丙基乙胺)、TFA(三氟乙酸)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲亚砜)、DCM(二氯甲烷)、ACN(乙腈)、EDC［1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐］、NMM(N甲基吗啉)和苯甲硫醚均由杭州中肽生化有限公司提供，哌啶经重蒸后使用，水为二次去离子水。
　HS1及其类似物的化学合成
本文所合成的5种环肽序列分别为
HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6Pro7
Leu8)；
A1HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3Pro4Tyr5Val6
Pro7Leu8)；
A2HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3statine4Tyr5Val6
Pro7Leu8)；
A3HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6
statine7Leu8)；
A4HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3statine4Tyr5
Val6Pro7Leu8)。
虽然这5种环肽或环肽类似物的序列如上面所表示的非常相似，并且按照顺序给每个氨基酸残基做了编号，但考虑到每个化合物的疏水性和空间位阻可能并不完全相同，加之合成的线性肽链终究要环化成环肽，因此，为了方便、有效地合成目的产物，我们选择接肽反应的第一个氨基酸也不尽相同。
(1)HS1的合成路线与纯化
树脂溶胀 调用自编程序Method1，树脂溶胀的具体方法是将FmocProCTC Resin (合成规模为)用200ml DMF浸泡30min，使之充分溶胀，然后抽干。
脱除氨基保护基 调用自编程序Method2，具体方法为加入含20%哌啶的DMF溶液20ml，搅拌反应30min，再抽干。然后用DMF洗涤5次，以除去残留的脱保护试剂。手工取样，茚三酮检测，若树脂呈深蓝色，则表明Fmoc保护基已经脱除。
接肽反应 调用自编程序Method3，具体方法是在反应器中加入溶解有 FmocValOH的200ml DMF溶液，搅拌2min，然后加入HBTU ，最后加入NMM ［AA∶HBTU∶NMM(mol/mol)=3∶∶6］，反应30min。抽干，用DMF洗涤3次，然后用甲醇洗涤树脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便手工进行茚三酮检测，检测结果若树脂呈现无色，则说明反应比较完全。依次调用程序Method2和Method3，按肽链的氨基酸序列依次用FmocTyr(2BrZ)OH、FmocProOH、FmocProOH等重复以上接肽反应，直至最终合成出所需肽链。合成顺序为：Pro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu。各氨基酸的投料比、接肽反应时间和脱保护基时间如表1所示。
后续类似物的合成中，表1所列参数基本不变。BocstatineOH的投料比为2，接肽反应时间为40min，脱保护基时间为30min。
肽链的切割 将合成肽链用切割液［TFA∶TIS(triisopropylsilane)∶H2O=∶∶］在低于20℃的条件下切割，反应时间为，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，4000表1 HS1合成中各氨基酸投料比、接肽反应时间r/min离心3min，真空干燥12h，得线性肽链的粗品约。
肽链的环化 将线性多肽粗品用200ml DMF溶解，依次加入EDC(2eq，)、BOP(1eq，)、HOBt(2eq，)和DIEA(5eq，)，过夜环化。加入EDC可以加速缩合反应。蒸干DMF，得环肽粗品，粗品用MALDITOF质谱仪进行分析鉴定。
环肽粗品的纯化 将上述环化粗品肽溶于适量DMSO中(由于此肽的水溶性不好，上样浓度要严格控制在小于1mg/ml)，上样样品用5μm的滤纸过滤。制备色谱柱为Waters XBridge C18、5μm反相柱；洗脱液：A液为% TFA的水溶液，B液为含% TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。采用60min内B液由30%～65%的线性梯度洗脱方式，流速为38ml/min。收集纯度高于95%的馏分。最后冷冻干燥，得100mg纯度大于90%的最终产品。
　　分析型HPLC检测纯度 色谱柱为SepaxGPC18反相柱(×150mm，5μm，120)；洗脱液：A液为% TFA的水溶液，B液为含% TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。采用20min内B液由60%～80%的线性梯度洗脱方式，流速为/min。
MS鉴定 激光解吸电离飞行时间质谱仪检测目标产物的分子量。
(2)A1HS1的合成路线与纯化 与HS1的合成略有不同，在A1HS1的合成中，合成方法主要有以下几点变化：①树脂改为FmocProMerrifield Resin；②氨基酸为Boc保护；③每连接一个氨基酸残基，要用50% TFA/DCM将肽链切割下来，然后脱保护、洗涤、活化树脂，再连下一个氨基酸残基，最后从树脂上将肽链切割下来的切割液为HF，时间；④纯化时梯度洗脱条件为B液：70%～100%；⑤HPLC分析时B液：61%～81%；⑥合成顺序为：Pro，Val，Tyr，Pro，statine，Ile，Ile，Leu。其余同HS1合成。冷冻干燥后得250mg纯度大于93%的最终产品。由于溶解度比HS1好，故收率较高。
(3)A2HS1的合成路线与纯化 类似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比较，在A2HS1合成中：①树脂为FmocProCTC Resin；②氨基酸为Fmoc保护；③最后切割液为F液，时间；④纯化时梯度洗脱条件为B液：65%～90%；⑤HPLC分析时B液：60%～80%；⑥合成顺序为：Pro，Ile，Ile，Leu，Pro，Val，Tyr，statine；⑦因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。其余同HS1合成。冷冻干燥后得268mg纯度大于92%的最终产品。由于溶解度比HS1好，故收率较高。
(4)A3HS1的合成路线与纯化 类似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比较，在A3HS1合成中：①树脂为FmocValWang Resin；②氨基酸为Fmoc保护；③切割液为F液，时间；④纯化时梯度洗脱条件为B液：43%～85%；⑤HPLC分析时B液：50%～70%；⑥合成顺序为：Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu，statine；⑦因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。其余同HS1合成。冷冻干燥后得245mg纯度大于98%的最终产品。由于溶解度比HS1好，故收率较高。
(5)A4HS1的合成路线与纯化 类似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比较，在A4HS1合成中：①树脂为FmocProMerrifield Resin；②氨基酸为Boc保护；③每连接一个氨基酸残基，要用50% TFA/DCM切割，然后洗涤，再连下一个氨基酸残基，最后从树脂上将肽链切割下来，切割液为HF，时间；④纯化时梯度洗脱条件为B液：62%～80%；⑤HPLC分析时B液：62%～82%；⑥合成顺序为：Pro，Val，Tyr，statine，statine，Ile，Ile，Leu；⑦因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。其余同HS1合成。冷冻干燥后得215mg纯度大于90%的最终产品。由于溶解度比HS1好，故收率较高。
　2 结果与讨论
　目标产物的合成
(1)环肽的代谢稳定性和生物利用度一般远高于直链肽［8］，但环肽的化学合成往往比较困难，尤其是首尾相连的环肽合成难度更大。本试验研究的5种肽或杂聚肽都是首尾相接的环肽，而且8个氨基酸残基都是疏水性氨基酸，给合成造成困难，也使得纯化更加不易。
(2)常规的固相合成中需要特殊的固相支持物。当用普通的Fmoc固相支持物时，在二肽阶段，由于环化引起的损失非常高，有些情况甚至导致所有肽链从固相支持物上损失，特别是若C端为氨基化Pro时。但Boc法则可以避免这类副反应。因此本研究中所采用的几种不同的树脂，即当C端为氨基化Pro时，采用Merrifield Resin，C端为其它氨基化氨基酸时，采用Wang Resin和CTC Resin。选择具有稳定的理化性质、足够多的反应位点及副反应少等优点的树脂，可以提高产物收率，降低纯化成本。
(3)本研究以HBTU/NMM(合成线性肽链)和BOP/HOBt/DIEA(环化时)作为复合型缩合试剂，NMH或DIEA提供反应所需碱性(后者碱性强于前者)。加入5倍量的DIEA目的是加快缩合速率，并提高产品收率。
　合成肽的纯化及纯化后的色谱分析
纯化时以TFA为交换离子对、以含% TFA的乙腈水溶液为洗脱液、采用线性梯度洗脱方式对目标肽进行纯化。纯化后的色谱分析结果显示，主峰面积较大，主峰旁无相似的峰，其它杂质峰面积相比于主峰面积要小得多，表明合成的粗品经反相高效液相色谱纯化后，目标肽的纯度得到了很大地提高(略)。
　合成肽纯化后的质谱鉴定
MALDIMS分析的结果显示，HS1、A4HS1的实际分子质量与理论分子质量相一致。A1HS1、A2HS1和A3HS1的实际分子量数值比理论 计算 值高一个单位，可能由于纯化过程中使用了TFA，肽能与TFA成盐造成。另外，质谱图中峰数较少，且主峰明显，说明合成的目标肽经色谱柱纯化后，可以除去大部分的杂质，从而得到较纯的目标肽(图略)。本研究中合成的5种肽分子量及纯度见表2。
　3 结论
本实验采用固相合成法制备HS1及含statine的4种类似物，经质谱仪分析检测，验证了合成产物的正确性。产物经RPHPLC纯化，纯度均达到90%以上，表2 本文合成的HS1及其类似物MS检测的分子量及纯度产品理化性质稳定，为下一步生物活性检测奠定了基础。
【 参考　文献 】
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