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新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备
【摘要】 目的：PCR扩增得到新基因ZNFD，构建pET32a-ZNFD原核表达载体，诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法：通过PCR的方法克隆新基因ZNFD，选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列，克隆到原核表达载体pET32a上，利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD，在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达，得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔，制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论：得到纯化的ZNFD蛋白，制备的多克隆抗体达到了一定的效价，且具有高特异性，为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。
【关键词】 ZNFD基因；锌指；原核表达；免疫抗原；多克隆抗体；聚合酶链反应
[Abstract] Objective：To clone ZNFD gene by PCR , construct expression vector ZNFD-pET32a, prepare and obtain its polyclonal antibody. Methods：The ORF fragment of ZNFD was amplified by PCR and sequenced. Part of ORF was cloned into pET32a prokaryotic expressing vector to form pET32a-ZNFD plasmid. His-ZNFD was expressed in E. coli Rosetta-gami(DE3) induced by IPTG and purified by using affinity chromatography. Purified His-ZNFD was used to immunize rabbits to prepare polyclonal antibody. Rabbit serum specificity and its titer were detected by double diffusion and Western blot. Results： The ZNFD gene was cloned and sequenced , and then pET32a-ZNFD was constructed successfully. His-ZNFD protein, 45 kD molecular weight, can be expressed in E. coli Rosetta-gami(DE3) with high efficiency. Its corresponding antibody was obtained by immunizing rabbit with the purified protein. The data of double diffusion and Western blot demonstrated that the purified antigen had high antigenicity. Conclusions：ZNFD gene was cloned and the purified fusion protein ZNFD was obtained, it had high antigenicity. Polyclonal antibody was prepared, which provided reliable tools for the future research.
[Key words] ZNFD gene; Zinc finger; Prokaryotic expression; Antigenicity; Polyclonal antibody; Polymerase chain reaction
锌指是存在于真核细胞转录因子中的重要结构域之一。1988年Pabo等对锌指下了一个定义：在调节蛋白一小段氨基酸序列中，含有几个Cys残基，这些区域为依赖锌的DNA结合域，它通过结合Zn2+自我折叠形成短的稳定的“手指”样结构[1]。锌指类蛋白广泛存在动植物和微生物中，它可选择性的结合特异的靶结构，调节靶基因的表达以适应生物体发育、分化和成熟等生命过程。从酵母到人体，其中人类基因组中可能有将近1%的序列编码含有锌指结构的蛋白质。1995年Klug等指出锌指蛋白基因这类转录因子与其他转录因子一样，具有重要的基因调控作用。锌指蛋白与胚胎发育、细胞分化以及人类许多疾病相关[4~6]。
本实验室使用电子克隆的方法获得了一个人类新基因,基因号为AY692447，将其同GenBank数据库相比较获得了该基因的可变剪切序列ZNFD，基因号为NM_182761尚未被研究，本实验室便对这个新基因展开了初步的研究。首先通过PCR克隆得到了ZNFD基因，经测序验证，证实其在人体内真实表达。然后对ZNFD基因进行生物信息学分析，该基因含有典型的C2H2型锌指结构，此类锌指蛋白基因具有重要的基因调控作用。基于以上的分析，我们成功的构建了原核表达载体pET32a-ZNFD，并表达纯化了蛋白，免疫家兔得到了多克隆抗体，为以后进一步研究该基因功能奠定了基础。
1 材料与方法
　材料 菌株E. coli Rosetta-gami(DE3)、E. coli Top10、质粒pET32a由本实验室保存。人的睾丸cDNA文库购于Clontech公司。限制性核酸内切酶、Taq DNA 聚合酶、pfu 高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pMD19-T载体、DNA Marker为TaKaRa公司产品。HRP标记的羊抗兔IgG、ECL试剂、PVDF膜购于碧云天。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂及其它生化试剂购于上海生物工程技术有限公司。新西兰大白兔购于苏州大学动物中心。
　方法
　PCR克隆人ZNFD基因 登陆GenBank数据库，获得一个人类的新基因ZNFD，基因号为NM_182761,使用Primer Premier 软件设计引物。PCR扩增该基因ORF引物：znf-up：5‘-CATGAAACGACGACAAAAGAG-3‘，znf-down：5‘- CTCAGTTCCTGTCCTTTGGAG-3‘。以人睾丸cDNA为模板，通过引物znf-up和znf-down特异性的扩增该基因的ORF区段，扩增的片段为1000 bp左右，PCR反应体系50 μl：cDNA模板， μl；引物znf-up和znf-down各25 pmol；dNTP，1 μl；DNA聚合酶3 U。扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共36个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，连接到pMD19-T载体上，由上海生物工程公司进行DNA测序。
　人ZNFD基因的核酸和蛋白质的特征分析
通过UCSC Genome Blat Server的人类基因组已有的数据，确定ZNFD基因的基因组结构以及染色体定位。使用NCBI中的ORF finder软件进行阅读框架的识别，按照GT-AG规则确定外显子与内含子的交界。以Protparam tool软件进行等电点和分子量计算。利用SMART网上分析工具进行结构域预测，以PSORT WWW Server进行蛋白细胞内定位预测。利用NCBI中的Unigene数据库进行表达谱分析。
　原核表达载体的构建与表达 PCR克隆得到人ZNFD基因，经测序鉴定其正确。通过DNAstar软件分析其抗原性较强的ORF区段，使用Primer Premier 软件设计原核表达扩增引物(其中在5‘端引物加入EcoRI酶切位点，在3‘端引物加入XhoI酶切位点)，ZNFD-F：5‘-TGGAATTCATGAAACGACGACAAAAG-3‘, ZNFD-R：5‘-TGCTCGAGTCAGGTCACCAGCCAGTCA-3‘。以测序正确的质粒pMD19T-ZNFD为模板，常规PCR反应扩增ZNFD基因，引物ZNFD-F和ZNFD-R。反应体系50 μl，引物各25 pmol；dNTP，1 μl；pfu高保真DNA聚合酶3U。扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃30 s、52 ℃ 30 s、68 ℃ 1 min，共36个循环，循环结束后68 ℃延伸10 min。PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，经EcoRI/XhoI双酶切后,与同样用EcoRI/XhoI双酶切的pET32a载体连接,并将连接产物转化感受态细菌Top10。
　转化 将重组质粒pET32a-ZNFD转化入表达菌株Rosetta-gami(DE3)。挑取单克隆于LB培养基中培养过夜。然后以1∶10的比例转接到3 ml培养基中，37 ℃培养至OD600约为~，加入终浓度为 mmol/L的IPTG在30 ℃诱导4 h，取100 μl菌液离心，加30 μl 1×上样缓冲液悬浮沉淀，煮沸5 min后12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后脱色。
　ZNFD融合蛋白的纯化 以上述方法在1000 ml培养基中大量诱导含His-ZNFD融合蛋白的表达。离心收集细菌经超声波破碎后收集上清，Ni离子柱纯化，样品过柱后依次使用洗涤缓冲液洗脱过柱。然后使用200 mmol/L的咪唑缓冲液过柱，将目的蛋白洗脱下来，取样SDS-PAGE电泳。对纯化的蛋白进行Bradford蛋白浓度的测定，并将其保存在-70 ℃。
　ZNFD多克隆抗体的制备 以纯化获得的ZNDF蛋白为抗原，取成年的雄性新西兰兔2只，在对其进行基础免疫前采血取血清备用，随后进行免疫。每次用抗原蛋白量为500 μg/只，每只兔子间隔2周免疫1次。首次免疫使用弗氏完全佐剂，将弗氏完全佐剂与抗原制成乳状液，背部皮下多点注射,之后的加强免疫使用弗氏不完全免疫方法同前。在第3次免疫后的第7天，从兔耳静脉中采取5 ml血样，作为抗体效价的检测使用。在抗体效价达到目的比例后，对兔子进行颈动脉放血后，收集血清。按常规方法分离血清：先在37 ℃培养箱放置2 h，然后4 ℃过夜。第2天10000 r/min，离心10 min，收集的上清加Na3N终浓度%，于-70 ℃保存。
　ZNFD多克隆抗体的鉴定 首先通过琼脂糖双向扩散实验检测效价。将融化好的1%的琼脂糖用滴管滴加到玻板上，制成琼脂糖凝胶板。待冷却后根据所需形状打孔，将抗原加入中心孔。倍比稀释的免疫血清加入周围孔，置于25 ℃湿盒中，保温24~48 h后观察抗原抗体产生的沉淀线。
　　其次采用蛋白质印迹法鉴定抗体特异性。以不同浓度的纯化ZNFD蛋白进行12%的SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜。以含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭后，将免疫的兔血清作为一抗，室温作用1小时。然后用TBST漂洗3次，之后加入HRP-羊抗兔IgG，室温反应1 h，TBST漂洗3次，ECL显影。
2 结 果
　PCR扩增ZNFD基因 通过Unigene数据库分析ZNFD基因在睾丸中有表达。以人睾丸cDNA文库为模板，通过PCR方法克隆ZNFD基因，产物大小约为1000 bp。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，连接到pMD19-T载体上，上海生工进行DNA测序。测序结果证明所得到的片段与ZNFD基因ORF框相同，证实了该基因在体内表达的存在。
　人ZNFD基因的染色体定位和基因组序列分析 PCR克隆得到人ZNFD基因后，对该基因的基因组序列、染色体定位进行了生物信息学分析。使用NCBI中的ORF finder软件进行阅读框架的识别，该基因cDNA全长1432 bp，其中含有990 bp的完整开放阅读框，编码329个氨基酸。起始密码子ATG，终止密码子TAG。而且在3‘末端的polyA尾上有一个加尾信号，为aataaa。根据其cDNA的全长序列检索人类基因组工作草图，结果表明ZNFD基因位于第5号染色体，定位在，按照GT-AG规则确定外显子与内含子的交界，该基因由5个外显子和4个内含子组成。
　ZNFD编码蛋白的生物信息学分析 以Protparam tool软件进行等电点和分子量计算，ZNFD编码的多肽有329氨基酸，分子量 kD，等电点。利用SMART网上分析工具进行结构域预测，结果显示ZNFD在氨基酸228-248的位置有一锌指结构，且属于C2H2型。利用PSORT WWW Server进行蛋白细胞内定位预测，结果显示该蛋白可能定位在细胞核内。
　人ZNFD基因的电子表达谱 以ZNFD基因的cDNA序列检索Unigene数据库，获得该基因的Unigene编号为。结果显示ZNFD基因在乳腺、肾脏、子宫、心脏、胰腺、肺、肠、肝脏、脑、睾丸等多种组织中表达。
　融合蛋白ZNFD的表达与纯化 将构建好的原核表达载体pET32a-ZNFD转化入表达菌株Rosetta-gami(DE3)中，经终浓度为 mmol/L的IPTG在30 ℃诱导表达4 h后，超声波破碎。然后使用Ni离子亲和柱纯化，最后12%SDS-PAGE电泳鉴定。电泳结果表明诱导出了一个45 kD左右的融合蛋白，并且通过Ni离子柱得到了该融合蛋白，这与我们预计的融合蛋白大小一致，该实验结果表明已经成功的诱导了融合蛋白ZNFD。
　ZNFD多克隆抗体的鉴定 通过免疫家兔4次后，得到抗血清，利用琼脂糖双向扩散实验，我们检测到所制备多抗的效价约为1∶16左右，达到了实验的需要。另外我们还采用蛋白质印迹法鉴定抗体特异性。以不同浓度梯度的纯化ZNFD蛋白进行Western blot检测(图5)，如图所示，在抗原20 ng时ECL仍能检测到蛋白，此时抗体稀释为1∶1000，已经达到了实验的要求。
3 讨 论
人类基因组计划中测序工作的基本完成或开展，丰富了相关数据库的信息内容，这为人类利用生物信息学的方法克隆新基因带来了新机遇。新基因搜寻和蛋白质功能分析是人类基因组图谱公诸于世后的研究热点。电子克隆是今年来伴随着基因组计划和表达序列标签计划发展起来的一种有效的基因克隆新方法。主要原理是利用日益扩充的生物信息学数据库，借助电子计算机的巨大运算能力，依据相关生物学原理，将EST或基因组的序列组装和拼接，进一步利用RT-PCR的方法快速克隆功能基因。随着人类基因组计划的实施，已有很多学者利用电子克隆的方法克隆了人的功能基因[9~11]。虽然人类基因组序列图谱已经构建完毕，但仍有许多新基因被不断发现和克隆。基于EST拼接的同源基因克隆法，仍然是一种挖掘和克隆新基因的有效手段。
本研究获取ZNFD基因后进行分析，发现ZNFD主要的特征是含有一个C2H2结构域，在其氨基酸228-248的位置有一锌指结构，具有以下同源保守序列：-X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-6His。锌指是存在于真核细胞转录因子中的重要结构域之一。可以选择性地结合特异的靶结构，调节靶基因的表达以适应生物体发育、分化、成熟等生命过程的需要。锌指蛋白与胚胎发育、细胞分化以及人类许多疾病相关。已有研究表明，C2H2型锌指蛋白在多种组织参与相关基因的表达调控。如ZNF23在多种人正常组织中高水平表达，但在人子宫内膜癌中的表达量下调且对细胞增殖起抑制作用；ZNF268仅在早期人胚胎中表达，对血细胞的分化和胚胎肝脏发育进行调控。我们已经验证了ZNFD基因在人睾丸组织中表达，可推断ZNFD基因可能在睾丸发育过程中和相关靶序列相结合调控下游的基因时序表达，进而影响着睾丸的发育。
基于以上的分析，随后我们成功的构建了原核表达载体pET32a-ZNFD，转化入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)进行诱导。将诱导表达的蛋白进行Ni离子柱纯化，得到纯化的蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。许多真核基因常常很难在大肠杆菌中获得高效表达，其原因之一是真核基因中含有许多大肠杆菌的稀有密码子，如精氨酸密码子和异亮氨酸密码子，因此在原核表达系统中表达量一直很低，一般不超过菌体总蛋白的10%。Rosetta-gami(DE3)菌株由于整合了编码tRNAs的基因，增加了大肠杆菌识别稀有密码子的能力，有效克服了蛋白翻译中稀有密码子的限制。实验结果表明Rosetta-gami(DE3)菌株作为宿主菌表达pET32a-ZNFD，表达量可以明显得到提高。本实验在多抗的制备上优化了方案，目的在于确保用合适的免疫程序获得预期的免疫结果且不引起试验动物过度的不良反应。由于我们用的是纯化的ZNFD重组蛋白，不包括外源融合成分，减少了制备的抗体的非特异性反应，也减少了对血浆中其他蛋白成分的交叉反应，特异性较好。我们还应用Western印迹法对ZNFD抗体的特异性进行了鉴定和分析，证明了所制备的抗体能与ZNFD抗原特异性结合。通过免疫方案的改良，本实验获得了较为理想的兔抗人ZNFD多克隆抗体，为后期ZNFD功能的研究，如ZNFD基因的表达分布，亚细胞定位，免疫组化，蛋白互作等研究提供了重要保证。
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