子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响.docx

子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响摘要目的：采用子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养，观察其对早期胚胎体外发育的影响。方法：对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离、培养鉴定，然后与体外受精的小鼠胚胎进行共培养，观察共培养对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。结果：与无上皮细胞相比，共培养明显促进了小鼠桑椹胚率，囊胚率，囊胚孵化率和胚胎总细胞数。结论：子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育，对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用。关键词子宫内膜上皮细胞；共培养；体外受精；小鼠Effects of Coculture of Mouse Embryo with Endometrial Epithelial Cells on Early Mouse Embryonic Development Abstract:Objective To observe the effects of coculture of mouse embryo with endometrial epithelial cells on early embryonic development inMouse endometrial epithelial cells were isolated and cultured,then it was cocultured with mouse embryos fertilized in vitro. The percentage of embryo cleavage, blastocyst hatching and total cell number of blastocyst were observed. Results Coculture with endometrial epithelial cells could promote the formation of mouse morula (% and %,) and blastocyst (% and %,), and increase the blastocyst hatched rate (% and %,) and total cell number of blastocyst ( and , ).Conclusion Coculture with endometrial epithelial cells can facilitate the development of early mouse embryo in vitro, which can optimize the condition of embryonic development in vitro.Key word: Endometrial epithelial cells;Coculture;In vitro fertilization;Mouse早期胚胎发育是一个极其复杂的过程，受到多种因素的影响。在生殖医学等多个领域，胚胎体外培养技术已得到很大的提高，胚胎与体细胞共培养因其能够克服体外发育阻滞、提高移植后胚胎着床率1等优势而成为一种有效的胚胎体外培养途径。共培养的方法很多，其中以采用雌性生殖道细胞的效果最佳2,3。为进一步研究体细胞对胚胎体外发育环境的影响，本实验采用小鼠子宫内膜上皮细胞和早期胚胎进行共培养，观察其对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。1材料与方法材料实验动物:15只20 g的昆明雌性小鼠购于中国科学院遗传与发育所实验动物中心。实验动物房光、暗周期均为12 h，饲养温度为24 26 ，自由采食饮水。试剂:DMEM培养基；胎牛血清；孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素(宁波激素制品厂)；兔抗人角蛋白多克隆抗体；生物素标记的羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Zymed公司);实验中其余所用化学药品和试剂购自Sigma公司。方法小鼠子宫内膜上皮细胞的分离培养:根据Wegner等人报道的方法从小鼠子宫组织中分离上皮细胞。调整细胞密度为5105/ml，细胞以 ml/孔接种于24孔培养板中，置入37 、95%湿度、5%CO2培养箱中培养。次日下午每孔更换 ml新鲜培养液，以后隔天换液一次。在接种后第56天，细胞完全生长汇合时，收集细胞进行冷冻保存。细胞的免疫染色:复苏的上皮细胞直接接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，放入培养箱中培养。待细胞单层形成后取出玻片，预冷的PBS漂洗，4%多聚甲醛室温下固定30 min，3%的H2O2孵育30 min，10%的正常羊血清封闭40 min；加一抗，4 孵育过夜；添加生物素标记羊抗兔的IgG，室温下孵育2 h；添加辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素，室温下孵育2 h；DAB显色，苏木精复染，封片。阴性对照采用PBS代替一抗，其它步骤相同。小鼠体外受精及胚胎培养:昆明小鼠体外受精和卵裂所用培养液分别为HTF和mKSOM，体外受精方法参见王敏康等人的报道。受精后体外培养24 h，均等卵裂为2-细胞者判定为受精卵。冷冻细胞复苏后接种于96孔培养板，体外培养3 d。共培养前用含% BSA的mKSOM培养基润洗细胞两次，加入新鲜mKSOM培养基。在无上皮细胞单层的培养孔中也同样加入新鲜mKSOM培养基作为对照组，培养板置于CO2培养箱预热3 h。受精卵随机放入对照组和实验组的各培养孔中，每孔放入胚胎2030个。置入37 、5%CO2的培养箱中培养，每24小时更换新鲜培养基，每日观察记录胚胎的发育情况。囊胚期胚胎细胞计数:囊胚期的胚胎用含1%多聚甲醛室温下固定5 min，固定好的胚胎移入Hoechst 33342染色液滴中，室温孵育5 min。孵育结束后胚胎转移至50的甘油中，混匀后转移至载玻片上制片，荧光显微镜下对胚胎总细胞数进行计数并拍照。数据处理每组实验重复46次，采用Sigmaplot软件对所有实验数据采用t检验进行统计分析，数据结果以均数标准差表示，为差异有显着性。2结果小鼠子宫内膜上皮细胞的分离培养在倒置显微镜下，胰酶消化后的子宫内膜上皮细胞呈团块状或葡萄状，接种24 h后仍有部分漂浮。3 d后细胞成团生长，排列紧密，单个的上皮细胞呈蝌蚪状，细胞将生长汇合至培养孔面积的80%左右。生长至第4天，细胞完全铺满板底，第56天后，上皮细胞已经失去细胞形态，细胞完全生长汇合为单层。细胞的免疫化学染色为了进一步鉴定细胞单层中上皮细胞的纯度，采用上皮细胞特异的细胞角蛋白抗体对细胞单层进行免疫细胞化学染色。染色结果表明：细胞角蛋白的阳性染色为棕色，主要分布在胞质区域，细胞核在复染后呈兰色；在对照组中，细胞质区域没有阳性反应。显微镜下随机选择6个不同的区域，计数不同区域内细胞总数和免疫染色阳性细胞数。统计结果表明，细胞单层中上皮细胞纯度为()%。共培养对早期胚胎发育的影响体外受精的小鼠胚胎与上皮细胞进行共培养，桑椹胚率和囊胚率分别为%和%，显着高于对照组(%和%，)，见表1。囊胚期胚胎细胞数也存在显着差异(和，)。囊胚期的胚胎在体外继续培养48 h，共培养组和对照组中囊胚的孵化率分别为%和%，两组之间亦差异显着()。表1子宫内膜上皮细胞对小鼠胚胎体外发育的影响注:N为重复染色的囊胚数；*表示各纵行的共培养组与对照组相比差异有显着性3讨论子宫内膜由上皮细胞、基质细胞和一些免疫细胞等组成。上皮细胞的胞浆高度表达细胞角蛋白，抗细胞角蛋白抗体与其可发生强阳性反应，而与基质细胞不发生阳性反应，故细胞角蛋白免疫反应是最简便的用于鉴定上皮细胞纯度的方法。目前对子宫内膜上皮细胞的分离和培养方法已有较多文献报道，但方法各一。Osteen等报道的方法中基质细胞纯度占8095，而上皮细胞的纯度低于基质细胞。也有报道上皮细胞纯度达90者，但操作步骤复杂，增加了污染的可能性。本实验采用Wegner等人报道的方法，根据上皮分离后成团及贴壁较慢的特性对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离培养，细胞单层中上皮细胞的纯度可达到()%，达到了较优的分离目的。到目前为止，胚胎体外培养技术已得到很大的提高，但仍然存在卵裂率、着床率低下等一系列问题。越来越多的研究资料显示，将体细胞作为营养细胞与胚胎共培养，可以促进早期胚胎发育，改善胚胎着床率1。正常生理条件下，早期胚胎主要从输卵管和子宫壁腺体分泌物中汲取营养物质。培养环境对早期胚胎发育的影响至关重要。而小鼠胚胎卵裂率和孵化率的高低直接反映了体外发育环境的好坏，是人类辅助生殖实验质量控制的重要参数之一。此外，囊胚期胚胎细胞数虽不能直接反映胚胎的发育潜力，但是也能够间接反映出胚胎体外培养环境的好坏，亦成为评价胚胎体外发育环境较灵敏的指标之一1。本实验中，我们将小鼠胚胎与子宫内膜上皮细胞进行共培养，结果表明胚胎桑椹胚率、囊胚率、孵化率及囊胚期胚胎细胞数明显高于对照组，说明本试验已成功复制了共培养模型，证明子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育，对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用。 关于胚胎共培养已有很多文献报道，但其作用机制仍不完全清楚。可能机制主要有三种：胚胎共培养体系中体细胞可以分泌一些对早期胚胎发育有利的物质，其中研究较多的是一些生长因子和糖蛋白10-11；通过体细胞来消除胚胎体外培养过程中一些不利因素，从而促进早期培养发育。其中包括螯合重金属离子，和能够抑制胚胎发育的物质次黄嘌呤等12；体细胞与胚胎的直接接触促进胚胎发育13。子宫内膜上皮细胞共培养系统可以优化胚胎体外发育环境，除了可以应用于人类生殖医学工程，还可为深入研究胚胎发育机制及动物胚胎工程提供优质的胚胎，具有较为广阔的应用前景，但是其作用机制仍需做进一步的研究。(文中图12见封三)参考文献1Jonesand viability of human blastocysts in vitroJ.Reprod Med Rev,2000,8(3):241-287.Carnegie JA,Morgan JJ,McDiarmid N,etof protein supplements on the secretion of leukaemia inhibitory factor by mitomycin-pretreated Vero cells: possible application to the in vitro production of bovine blastocysts with high cryotoleranceJ.J Reprod Fertil,1999,117(1):41-48.Yeung WSB,Lee CKF,Xuoviduct and development of the preimplantation embryoJ.Reprod Med Rev,2002,10(1):21-44.Wegner CC,Carsonuterine stromal cells secrete a 30-kilodalton protein in response to coculture with uterine epithelial cellsJ.Endocrinology,1992,131(6):2 565-2 572.Andras N,Marina G,Kristina V,etthe mouse embryo,Third editionM.New York：Cold 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