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126 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响王天琦1，吴海歌1，2*，姚子昂1(1.大连大学生命科学与技术学院，大连辽宁116622;2.中国科学院大连物理化学研究所，大连辽宁116622)摘要:目的研究 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响。方法原代培养小鼠皮肤成纤维细胞，传代培养后加入不同浓度的 卡拉胶寡糖作用，应用细胞计数法，四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法，检测 卡拉胶寡糖对皮肤成纤维细胞增殖的影响，ELISA 法检测 卡拉胶寡糖对皮肤成纤维细胞分泌型、型胶原蛋白的影响。结果 12.5g/mL100g/mL 范围内，各组 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞均有一定促进增殖作用，其中以 100g/mL 时最为显著(P 0.01)。用 25g/mL 和50g/mL 卡拉胶寡糖处理小鼠皮肤成纤维细胞后，与对照组相比，型胶原蛋白分泌明显增加(P 0.05);12.5g/mL100g/mL 范围内，各组 卡拉胶寡糖均显著促进型胶原蛋白分泌(P 0.05)。结论 卡拉胶寡糖能有效促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌。关键词:卡拉胶寡糖，成纤维细胞，细胞增殖，胶原中图分类号:TS202.3文献标识码:A文章编号:1006 2513(2013)01 0126 04Effects of carrageenan oligosaccharides on cell proliferationand collagen secretion in cultured mouse skin fibroblastWANG Tian-qi1，WU Hai-ge1，2*，YAO Zi-ang1(1 School of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian Liaoning116622;2 Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian116622)Abstract:Objective:To investigate the effect of carrageenan oligosaccharides on cell proliferation and collagen se-cretion in cultured mouse skin fibroblasts Methods:The primary mouse skin fibroblasts were isolated and cultured invitro The cells were treated with carrageenan oligosaccharides in different concentration in exponential phase of cellgrowth The cell proliferation was measured by cell counting and MTT colormetric assay Typeand type collagensecretion was detected by ELISA Results:Compared with the control group，the growth of mouse skin fibroblasts wasenhanced When the cells were stimulated by carrageenan oligosaccharides，100g/mL is most significant(P 0.01)Typecollagen secretion was increased(P 0.05)after the cells were stimulated by 25g/mL and 50g/mL carrageenan oligosaccharides;type collagen secretion was increased(P 0.05)after the cells were stimulatedby carrageenan oligosaccharides Conclusion:carrageenan oligosaccharides can enhance the growth of mouseskin fibroblasts and collagen secretionKey words:carrageenan oligosaccharides;fibroblast;cell proliferation;collagen收稿日期:2012 11 13基金项目:国家自然科学基金资助项目资助，项目编号:81070973、30901875、30970645。作者简介:王天琦(1987 )，女，硕士研究生，研究方向为海洋生物活性物质。127海洋中蕴含丰富的自然资源，随着海洋生物学的发展，海洋生物活性物质越来越受到关注。卡拉胶(carrageenan)是自海洋红藻中提取的酸性多糖，在食品工业中通常将其用作增稠剂、胶凝剂、悬浮剂、乳化剂和稳定剂等。卡拉胶寡糖是由卡拉胶降解而来的一种酸性硫酸寡糖，根据半乳糖中是否含有内醚以及半乳糖上硫酸基的数量和连接位置不同，分为 、七种类型1。卡拉胶寡糖具有免疫调节2、抗肿瘤3，4、抗氧化5，6、抗菌7、抗病毒8 等生物学活性，同时具有对放射性损伤的保护作用9。本文以 卡拉胶寡糖和小鼠皮肤成纤维细胞为研究材料，研究 卡拉胶寡糖可能在皮肤中起到抗衰老的作用及其机理，为开发利用功能性寡糖提供依据。1材料和方法1.1材料 卡拉胶寡糖:卡拉胶购自郑州世纪安华商贸有限公司，用本实验室筛选的 Cellulophagalytica strain N5 2 产生的 卡拉胶降解酶降解 卡拉胶，经过除盐，除蛋白，得到 卡拉胶寡糖。用 DMEM/F12 培养基配制，实验终浓度为12.5g/mL、25g/mL、50g/mL、100g/mL。1.2细胞原代培养正常小鼠来源于大连大学实验动物中心，均为新生小鼠。断颈处死后，用 75%乙醇浸没 3 到5s，转移至超净工作台中，在含 1%的双抗和庆大霉素的 PBS 中浸洗 3 次。取乳鼠的背部皮肤，尽量去除皮下组织，用含 1%双抗和庆大霉素的PBS 冲洗，解剖刀轻划表皮部分。放入 2mg/mL的分离酶中，37消化 1.5h。置于培养皿中，真表皮分离，将真皮置于 PBS 中清洗 2 遍。之后放入装有少量 PBS 的小烧杯中，用解剖剪将真皮剪碎，剪到剪不碎为止，用 PBS 小心清洗 3 遍。然后将组织转移到 0.25%的胰酶中，37消化。当消化液开始变混浊，皮肤块互相分离，边缘模糊时，停止消化。一般消化时间为 1015min。静置或离心，弃胰酶，加入含 15%胎牛血清的DMEM/F12 培养液，吹打。分别转移至 25mL 培养瓶中，加入少量 DMEM/F12 培养液。第二天换液，之后每 3 天换液，达到 70%到 80%融合时传代。实验使用第 3 5 代融合培养的成纤维细胞。1.3细胞计数法绘制生长曲线用 0.25%的胰酶消化单层贴壁成纤维细胞，DMEM/F12 培养液配制成单细胞悬液，以 1 104个/孔接种于 96 孔培养板中。培养 24h 后，弃去培养上清液，加入 0.1mL 不同浓度的 卡拉胶寡糖，设置空白对照组。分别在 0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d 消化细胞进行细胞计数，每组6 个复孔。隔天给未计数的细胞换液，并加药。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线。1.4四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖取对数生长期的细胞，以 5 104个/mL 接种于 96 孔培养板培养，每孔 100L。CO2箱培养24h。按照分组加入不同浓度的 卡拉胶寡糖，设置空白对照组。每组 6 个复孔。移入培养箱，36.5，5%CO2，饱和湿度下继续培养 48h，加入浓度为 5g/L 的 MTT(20L/孔)，继续培养 4h后加 入 二 甲 基 亚 砜(150L/孔)，于 波 长 为570nm 处测各组吸光度值。相对增殖率 RGR(%)=实验组 OD对照组 OD100%1.5ELISA 法测定 卡拉胶寡糖对皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响将成纤维细胞以 1 106接种于 6 孔板中。24h 后加入 1mL 卡拉胶寡糖溶液，药物作用24h 后，收集上清，用 Elisa 法检测，严格按照试剂盒说明书操作，测定 型、型胶原蛋白含量。1.6统计学分析应用 SPSS16.0 统计软件，结果以(x s 表示，采用单因素方差分析(ONE WAY ANOVA)，P 0.05 时差异显著。2结果2.1细胞计数法测定细胞增殖经 卡拉胶寡糖作用 2d 后，12.5g/mL、25g/mL、50g/mL 和 100g/mL 浓度组成纤维细胞增殖活跃，直至作用后第6d 达平台期。从生128长曲线来看各浓度 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞均有一定促进增殖作用。其中，以100g/mL 卡拉胶寡糖组最为明显，细胞提前进入平台期，细胞倍增时间由对照组的 3.49 天减少至 3.00 天。见图 1。图 1不同浓度 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞生长曲线的影响2.2四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖 卡拉胶寡糖在 12.5g/mL、25g/mL、50g/mL 和 100g/mL 时均有明显促进成纤维细胞增殖的作用。随着药物浓度增高，促进增殖作用更加明显，具有剂量依赖性。详见图 2。图 2不同浓度 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞相对增值率的影响注:与对照组相比，*P 0.05，P 0.012.3ELISA 法测定 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞培养基中型、型胶原蛋白含量增高明显，尤其是明显促进型胶原蛋白分泌，各组 P 0.05。详见表 1。表 1不同浓度 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响浓度(g/mL)型胶原蛋白(ng)型胶原蛋白(ng)0118.59 16.85111.74 15.1112.5140.21 4.99224.78 16.91*25157.85 7.49*217.17 16.91*50160.50 16.22*192.17 4.61*100154.76 19.34188.91 13.84*注:与对照组相比，*p 0.053讨论衰老是生物界最基本的自然规律之一。它是一个渐进的过程，导致机体所有器官的机能减退和储备能力的下降。皮肤老化按其成因分为内源性和外源性。内源性皮肤老化主要是指随着年龄增长而出现的全身皮肤松弛和皮纹加深;通过环境因素或者生活方式的原因产生的损害积累，属于外源性老化。内源性和外源性皮肤老化均表现为真皮组织的显著变化10，11。成纤维细胞是皮肤真皮中最主要的细胞成分，在合成分泌纤维和细胞外基质中扮演着重要的角色。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白，弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋白等基质成分 12。皮肤老化与成纤维细胞数量减少、合成功能下降或异常有关 13。另外，衰老皮肤在组织学上一个比较突出的表现是细胞质基质中胶原的减少 14，所以防治皮肤衰老目的就是增加成纤维细胞数量，恢复细胞外基质的正常结构，增加胶原含量。卡拉胶寡糖具有多种生物活性，本研究中，12.5g/mL 和 25g/mL 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞具有显著促进增殖作用(P 0.05)，50g/mL 和 100g/mL 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞具有极显著促进增殖作用(P 0.01)，且促增殖作用与药物作用浓度呈正比。100g/mL 的浓度下，在加药后第二天显现出明显促进成纤维细胞增殖的迹象，并使细胞提前进入平台期，细胞倍增时间减少，加速新陈代谢。另外，卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细129胞分泌型、型胶原蛋白含量影响明显，具有显著促进作用(P 0.05)。其中，在 12.5g/mL100g/mL 范围内，卡拉胶寡糖可促进成纤维细胞生长，并呈量效依赖，但 卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞分泌型胶原蛋白含量的影响，并未呈现与细胞增殖时相应的量效关系。说明低浓度 卡拉胶寡糖就可显著促进型胶原蛋白的分泌，在较高浓度时 卡拉胶寡糖可能主要促进细胞增殖，而在相同的时间里与低浓度处理组相比胶原蛋白的分泌相对较少。其促进胶原分泌的机理有待进一步研究。以上结果显示，卡拉胶寡糖具有促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖及胶原蛋白的分泌的作用。参考文献:1 Jing MHSeaweed chemistry M Beijing:Science Press，1997:117 187 2 Huamao Yuan，Jinming Song，Xuegang Li，et al Immunomod-ulation and antitumor activity of carrageenan OligosaccharidesJ Cancer Letters，2006，243:228 234 3 Mou Haijin，Jiang Xiaolu and Guan HuashiA carrageenanderived oligosaccharide pre pared by enzymatic degradation con-taining antitumor activity J Journal of Applied Phycology，2003，15:297 303 4 Huamao Yuan，Jinming Song Preparation，structural character-ization and in vitro antitumor activity of kappa carrageenan oli-gosacharide fraction from Kappaphycus striatum J Journal ofApplied Phycology，2005，17:7 13 5 Huamao Yuan，Jinming Song，Weiwei Zhang et al Antioxidantactivity and cytoprotective effect of carrageenan oligosaccha-rides and their different derivatives J Bioorganic MedicinalChemistry Letters，2006，16:1329 1334 6 Xiaoke Hu，Xiaolu Jiang，Eric Aubree，et alPreparation andin vivo antitumor activity of carrageenan oligosaccharides J Pharmaceutical Biology，2006，44(9):646 650 7 王秀武，杜昱光，白雪芳，等 卡拉胶寡糖对肉仔鸡肠道菌群、小肠微绒毛及免疫功能和生产性能的影响 J 中国兽医学报，2004，24(5):498 500 8 Yamada T，Ogamo A，Saito T，et al Prepara tion of O acy-lated low molecular weight carrageenans with potent anti HIV activity and low anticoagulant effect J Carbohydrate Pol-ymers，2000，41(2):115 120 9 李翊，王海青卡拉胶寡糖对放射损伤的防护作用 J中华放射医学与防护杂志，2005，25(2):116 117 10 Lavker RM，Kligman AMChronic helioder matitis:a mor-phologic evaluation of chronic actinic dermal damage with em-phasis on the role of mast cells J Invest Dermatol，1988，90:325 330 11 Gilchrest BA Skin aging and photoaging:an overview J JAm Acad Dermatol，1989，21:610 613 12 邹仲之 组织学与胚胎学 M 北京:人民卫生出版社，2004:22 23 13 Gilchrest BA，Yaar M Ageing and photo ageing of the skin:observations at the cellular and molecular level JBritishJournal of Dermatology，1992，127(41):25 14 Fisher GJ，Kang s，Varani J，et al Mechanisms of Photoagingand chronologicaI skin aging J Arch Dermatol，2002，138(11):檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴殜殜殜殜1462紧紧围绕国家法律和标准编纂的大型工具书新版 食品添加剂手册已正式出版发行中国食品添加剂和配料协会编著中国轻工业出版社出版发行联系人:杜鉴电话:[phone]传真:[phone]E-mail:cfaa1803 网址: