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嗜麦芽寡养单胞菌与金属β内酰胺酶
【摘要】 嗜麦芽寡养单胞菌耐药性强，产金属β内酰胺酶是嗜麦芽寡养单胞菌对包括亚胺培南在内的广谱头孢菌素耐药的主要原因，金属酶作用机制复杂，没有相应的抑制剂投入　，已成为抗感染 治疗 很棘手的 问题 。本文就嗜麦芽寡养单胞菌所产金属β内酰胺酶种类、特性、作用机制和抑制剂等方面 研究 作一简要概述。
【关键词】 嗜麦芽寡养单胞菌 耐药性 金属 内酰胺酶
Stenotrophomonas maltophilia and metalloβlactamase
ABSTRACT Stenotrophomonas maltophilia was multiresistant. Production of metalloβlactamase is one of the resistance mechanism of　to cephems and carbapenems.　The　mechanisms of metalloβlactamase were complicated and no corresponding inhibitor has been used,　which　has become a difficult problem in the treatment of infections diseaes. The kinds, characteristics, mechanism and inhibitors of metalloβlactamase produced from　were reviewed.
KEY WORDS Stenotrophomonas maltophilia; Drug resistance; Metalloβlactamase
嗜麦芽寡养单胞菌是一种引起 医院 内感染的常见条件致病菌。近年随着广谱抗生素，尤其是碳青霉烯类抗生素的广泛应用，该菌的感染率不断增加。嗜麦芽寡养单胞菌的外膜渗透性低，抗菌药物不能有效达到相关部位。另外，该菌产生青霉素酶、头孢菌素酶和含锌离子的金属β内酰胺酶(MBL)，可水解多种抗菌药，导致药物失活。产金属β内酰胺酶是嗜麦芽寡养单胞菌对包括亚胺培南在内的广谱头孢菌素耐药的主要原因，现缺乏有效的抑制剂，已成为临床抗感染治疗中很棘手的问题。因此MBL的研究越来越受到重视。
1 金属β内酰胺酶的产生和　
金属β内酰胺酶(简称金属酶)是一种依赖Zn2+的超广谱β内酰胺酶，可水解几乎所有的β内酰胺酶类抗生素，包括碳青霉烯类，而且水解活性不能被传统意义上的β内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦等)抑制［1］。金属酶家族的基因相互之间的一级结构有低水平的相似性(大多数情况下少于40%或少于11%的氨基酸一致)，但三维结构呈现高水平的相似性，故拥有四个同样的主要特性：①能够水解碳青霉烯类抗生素；②对单环类药物敏感；③对螯合剂(如EDTA)敏感；④对锌离子有依赖性。
第一个被报道的金属酶Ⅱ是从蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中发现的，其活性依赖于锌离子。20世纪80年代初期，日本从嗜麦芽寡养单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素L1酶，随后又从嗜水气单胞菌中脆弱拟杆菌、居泉沙雷菌和戈氏军团菌中鉴定出水解亚胺培南的金属酶。这些菌的MBL基因绝大多数位于染色体上，限制了此酶的菌株间传播。此类MBL称为天然来源的MBL，上述菌都是条件致病菌，除嗜麦芽寡养单胞菌和炭疽杆菌很少引起严重感染。20世纪90年代日本发现的金属酶IMP1，由于其编码基因位于可移动的质粒上，引起人们极大的重视［2］，随后在肺炎克雷伯菌及黏质沙雷菌中检测到IMP1，在一些非发酵的肠杆菌中也发现有IMP1酶的产生，且产酶菌株比例逐渐上升。金属酶基因的表达可以是诱导型也可以是非诱导型。含金属酶基因的脆弱拟杆菌(约%～4%)表达水平大多很低，不引起产酶菌耐药，也不被β内酰胺酶类化合物诱导。当启动子突变或启动子内插入IS元件时可导致表达水平增高，引起产酶菌耐药。含金属酶基因嗜麦芽寡养单胞菌、嗜水气单胞菌和简达气单胞菌均可被诱导表达［3］。由于其编码基因位于质粒上或Ⅰ类整合子的IMP和VIM型MBL，可通过各种方式或在其它细菌体内得到表达。 目前 临床上使用的所有β内酰胺酶抑制剂对他们均无效，易造成广泛传播。目前为止，已发现30多种金属酶，IMP类21种，VIM11种，还有SPM1和GIM。
2 金属β内酰胺酶分类
关于β内酰胺酶分类 方法 有两类。一种是Ambler等［4］提出的根据β内酰胺酶分子结果氨基酸序列差异，将β内酰胺酶分为A、B、C、D等4种类型，金属β内酰胺酶属于B类；另一种是1995年Bush等［1］提出的根据β内酰胺酶的功能分类。根据底物和抑制剂不同，将其分为4个群，金属β内酰胺酶属于第三类群。若根据金属β内酰胺酶的底物特征，又将其分为3a、3b和3c三个亚群。3a亚群金属β内酰胺酶包括B1和B3两个亚类。B1亚类在蜡状芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、黏质沙雷菌和铜绿假单胞菌等中发现，B3亚类在嗜麦芽寡养单胞菌中发现，其水解β内酰胺类抗生素同B1亚类一样广泛［5～9］。3b亚群包括B2亚类，多来自气单胞菌属、黄杆菌属和洋葱伯克霍尔德菌属等。特点是底物特异性高，优先水解碳青霉烯类抗生素，弱水解青霉素和头孢菌素，不水解头孢噻吩。所以并不导致青霉素、头孢菌素耐药，属于真正意义上的碳青霉烯酶。3c亚群主要产自戈氏军团菌，能高效水解头孢菌素类和碳青霉烯类。
3 嗜麦芽寡养单胞菌金属β内酰胺酶特点及作用
嗜麦芽寡养单胞菌对β内酰胺类抗生素头孢他啶、头孢哌酮、亚胺培南/西司他丁钠盐和氨曲南的耐药率80%，加酶抑制剂抗生素头孢哌酮/舒巴坦的耐药率较头孢哌酮略低，但也提示ESBLs和MBL都参与了对β内酰胺类抗生素的耐药。对产MBL的嗜麦芽寡养单胞菌菌株进行体外药物活性比较，结果大多数β内酰胺类抗生素对产MBL株和非产MBL株敏感性相似，但产MBL株的对亚胺培南/西司他丁钠盐完全耐药，对氨曲南的敏感性高于非产MBL株，这可能与MBL的酶学特性有关。
嗜麦芽寡养单胞菌可产碳青霉烯水解酶，包括Bush分类为3类的金属β内酰胺酶L1酶和一种少见的头孢菌素酶XMA型酶［10］。L1酶和L2酶的酶学特性及基因序列现已明确，两者都为可诱导酶，亚胺培南和头孢噻肟是诱导剂，L1酶是一种依赖锌离子的存在而发挥催化活性的酶，种类多样，结构不同，等电点不同，产酶率较高，该酶为四聚体，含2个Zn2+，酶活性依赖Zn2+的存在。该酶以包括碳青霉烯类在内的一大类β内酰胺类抗生素为底物，其活性可被离子螯合物EDTA、菲咯啉或巯基类化合物所抑制，但不能被常见的β内酰胺类抗生素如克拉维酸所抑制。卓超等［11］通过PCR扩增出2株金属β内酰胺酶编码基因，经测序比较与国外报道的L1酶编码基因(blaS)同源性为99%，对13株MBL阳性株嗜麦芽寡养单胞菌的耐药模式进行 分析 ，11种抗菌药表现出8种耐药模式，不仅不同基因可有不同的耐药模式，同一种耐药模式可表现为不同基因型，表明细菌耐药模式和基因型之间也无明确相关性。可能的原因有：①耐药基因通过质粒或其他机制传播，使不同的的基因型菌株获得耐药基因，产生相同的耐药模式。Avison等［12］研究发现，嗜麦芽寡养单胞菌携带的L1和L2酶编码基因可位于同一个约200kb的质粒上；②同一种基因型的菌株在外界因素作用下(如抗生素选者择压力)发生基因突变， 影响 其耐药机制，而表现为不同的耐药模式。经接合传递的嗜麦芽寡养单胞菌的β内酰胺酶具有IMP的诱导型表达，而且酶活性可被克拉维酸抑制，故可传递的耐药性可能不是L1、L2酶所致，是由质粒携带的可水解青霉素类及第三代β内酰胺酶类抗生素的广谱β内酰胺酶。
以往对β内酰胺酶L1、L2在共同的调节机制的研究发现L1、L2不共同表达，但调控机制间有共同之处。根据基因序列，已发现L1有a、b、c、d和e型，L2也有a、c、d、e型，L1e最少见，与其它酶的水解活性明显不同，可能与底物结合区的几个非保守氨基酸不同有关。另外发现的三个新基因bl2c、bl2d、bl2e与bl2相比有4%、9%和25%的不同。L1、L2的DNA和氨基酸序列的株间变异均可达30%，二酶的异质性为嗜麦芽寡养单胞菌染色体酶所特有［12］，故L1、L2进化相当快，其进化的驱动力可能与β内酰胺酶类抗菌药物的选择压力有关。
4 嗜麦芽寡养单胞菌金属酶的检测
PCR是检测金属酶最为准确可靠的方法，特异性和灵敏度都很高。参照GenBank的嗜麦芽寡养单胞菌所产生的MBL的全基因序列，设计出一对保守性好的通用引物，P1：5′GTTTTACACCCTCGCCTTCGCCCT3′，P2：5′GCGGGTCCCGGCCGTTTCCCTGGCCAA3′。但PCR方法容易漏检新型基因，技术要求较高，费用较大，不利于实验室的常规检测。用巯基化合物(2巯基丙酸，巯基乙酸)对金属酶的抑制作用检测金属酶，易产生假阳性［11］。采用亚胺培南乙二胺四乙酸钠(IMPEDTA)增效试验［13］检测金属酶，与PCR方法有着同样的准确性，并且更简单实用。使用脉冲场凝胶电泳(PFEG)的方法可以进行流行病学研究［14］。
5 嗜麦芽寡养单胞菌与金属β内酰胺酶抑制剂的研究
因为金属β内酰胺酶活性位点有锌离子，因此克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦等抑制或灭活β内酰胺酶丝氨酸位点的酶抑制剂，对金属β内酰胺酶没有作用，并且由于金属酶的存在，此类抑制剂甚至对A、C、D类的抑制活性也受到影响。
　　Denny等［15］发现黄酮类化合物高良姜黄素能够对部分从嗜麦芽寡养单胞菌中提出的金属β内酰胺酶起到抑制作用，抑制效果并不能被加入金属离子ZnCl2而抑制，表明抑制作用与金属螯合作用无关。黄酮类化合物五羟黄酮对该金属β内酰胺酶也有一定抑制作用。建立在该酶的晶体结构上的分子模型显示高良姜黄素在该金属β内酰胺酶的活性位点上有一定定向的作用。提示黄酮类化合物的化学结构对金属β内酰胺酶有一定的 影响 。
Payne等［16，17］探讨了巯基乙酸硫羟酸酯对金属型(B)型β内酰胺酶的抑制作用。SB214751(2)、SB213079(4)和SB216271(1)都显示了对嗜麦芽寡养单胞菌L1金属酶极大的活性，并显示为对蜡状芽胞杆菌Ⅱ酶的不可逆的抑制作用。这些巯基乙酸硫羟酸酯衍生物也对不同金属β内酰胺酶具有抑制作用，对嗜麦芽寡养单胞菌L1酶显示最敏感的抑制活性，但对脆弱拟杆菌CfiA酶均无抑酶活性，这是因为这一抑制剂在蜡状芽胞杆菌Ⅱ，嗜水气单胞菌CphA和嗜麦芽寡养单胞L1酶的活性位点与脆弱拟杆菌CfiA酶的活性位点不尽相同。
金属酶作用机制复杂，没有相应的抑制剂投入　，从以上的 研究 中可为研究抗金属β内酰胺酶的新药研究提供方向和可能性。
6 结语
尽管金属β内酰胺酶与其它丝氨酸β内酰胺酶相比种类和数量较少，但其耐药性更广泛，另外，金属酶的异质性使研究专门针对于金属酶的抑制剂很困难。因此对其进一步深入研究并开发出高效的金属酶抑制剂是今后一个重要方向。
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