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-葡萄糖苷酶产生菌的选育及其性质研究朱 凤妹1,2,李军2,杜彬3,刘 长江1(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳110161;2.河北科技师范学院食品工程系,河北昌黎066600;3.河北科技师范学院分析测试中心,河北昌黎066600)摘要 目的 筛选-葡萄糖苷酶高产菌株,确定产酶的最佳工艺条件。方法利用几种黑曲霉进行产-葡萄糖苷酶的筛选,得到1 株-葡萄糖苷酶高产菌株黑曲霉3.316。通过单因素和正交试验,确定产酶的最佳工艺条件,研究不同碳源(麸皮、可溶性淀粉、豆粕和米糠)在相同碳源浓度(2%)及相同发酵条件下对-葡萄糖苷酶活力的影响。结果 -葡萄糖苷酶高产菌株的最佳产酶工艺条件为:麸皮2%,蛋白胨0.1%,KH2PO40.1%,初始pH 值6.0。测得酶活力为152.20 U/m g。-葡萄糖苷酶酶学性质的测定结果表明,反应液浓度为0.1 m ol/L 醋酸缓冲液时酶活力最高,最佳反应温度为55,pH 为5.0。结论 不同碳源对产酶有较大影响,麸皮做碳源时产酶最高。关键词 -葡萄糖苷酶;黑曲霉;选育;性质中图分类号 Q55 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)03-00860-03Breed in g o f S tra in Produc in g -glu cosida se an d R e searchonits Ch aracte risticsZHU Feng-m e i e t a l (C ollege of F ood Sciences,Shenyang A gricu ltural U n iversity,Shenyang,L iaon ing 110161)Abstrac t O bjective T he study aim edto screenthe h igh-yield strain of -glucosidase and con firmthe op ti m umtechnological conditionof enzym e pro-duction.M ethod Several species of A spergilluse n iger w ere screened for p roducing -g lucosidase and A.niger 3.316,a h igh-yield strain of -glucosi-dase w as obtained.The op tim umtechnological cond itionfor producingthe enzym e w as con firm edthrough sing le factor and orthogonal experi m en ts and thein fluences of d ifferen t carbon(C)sources(bran,soluble starch,soybean m eal and rice bran)on -glucosidase activity underthe sam e Csource concen-tration(2%)andferm en tation condition.R esu lt The op tim umtechnological cond itions forthe h igh-yield strain o f -glucosidase producing the enzym ew ere as follow s:2%bran,0.1%pep tone and 0.1%KH2PO4andinitia l pHof 6.0.The de term inedenzym e activity w as 152.20 U/m g.The enzym o logi-cal de term ina tion on-glucosidase show edthat w henthe reactionconcen tration w as 0.1 m ol/Lacetic acidbu ffer,the enzym e activ ity w as h ighest.T he op-tim umreaction tem peratu re w as 55 andthe op tim umreaction pHw as 5.0.C onclusion D ifferen t Csou rces had bigger in fluences onthe enzym e pro-duction,w h ich w as h ighest w hen the Csou rce w as bran.K ey words -glucosidase;Aspergilluse niger;B reeding;P roperty?作者简 介 朱凤妹(1978-),女,河北 沧 州 人,讲 师,从 事 食 品 生物 技术方面 的研 究。收稿 日期 2007-09-26 -葡萄糖苷酶(-g lucosidase,EC 3.2.1.21)又称-D-葡萄糖苷水解酶,属纤维素酶1,是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶2。据其底物特异性将其归类于烃基-葡萄糖苷酶、纤维二糖酶或水解烃基-糖苷基和寡聚糖的酶类。-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛,几乎在所有生物体中都有,因其来源不同而性质各异,在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。随着从大量嗜热性细菌分离出了-葡萄糖苷酶后,由于其高度的耐热稳定性及高活性而对纤维质糖化工业 极 为 有 利,日 益 受 到 人 们 的 重 视。黑 曲 霉(A s-perg illus niger)是公认的安全菌株,而且该菌产-葡萄糖苷酶活力较高3。笔者通过对几个菌株的黑曲霉进行选育,得出一株-葡萄糖苷酶高产菌,并对其性质做进一步研究,以期为工业化生产提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种。黑曲霉3.316 和黑曲霉3.4523(中国普通微生物保藏管理中心);黑曲霉1、黑曲霉2 和黑曲霉3(河北科技师范学院食品工程系微生物教研室保藏菌种)。1.1.2 化学试剂。水杨苷。10 m g/m l 葡萄糖标准贮备溶液:称取于(103 2)下烘干至恒重的无水葡萄糖1 g,精确至0.1 m g,用水溶解并定容至100 m l。DN S 试剂:称取3,5-二硝基水杨酸(10 0.1)g,置于约600 m l 水中,逐渐加入氢氧化钠10 g,在50 水浴中(磁力)搅拌溶解,再依次加入酒石酸钾钠200 g、苯酚(重蒸)2 g 和无水亚硫酸钠5 g,待全部溶解并澄清后,冷却至室温,用水定容至1 000 m l,过滤。贮存于棕色试剂瓶中,于暗处放置7 d 后使用4。0.1 m ol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液。菲林试剂。混合指示剂:0.1%甲基红乙醇溶液 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液1 5,用时混合。1.1.3 培养基。斜面培养基(PDA)。马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼 脂 15 20 g,水1 000 m l,pH 自 然,121 灭 菌 20m in5。种子培养基。可溶性淀粉20 g,葡萄糖10 g,M gSO41 g,KH2PO41 g,N aNO32 g,酵母膏5 g,pH 自然,121 灭菌20m in。产 酶 发 酵 培 养 基。麸 皮 20 g,(NH4)2SO40.5 g,KH2PO41 g,M gSO4 H2O1 g,尿素1 g,醋酸钠0.5 g,抗坏血酸0.5 g,自然pH,121 灭菌20 m in。固态发酵培养基。称取10 g 麸皮加入250 m l 三角瓶中,加水15 m l,pH 自然,121 灭菌20 m in。1.1.4 仪器。723 型可见光分光光度仪:上海光谱仪器有限公司;PH S-酸度计:上海雷磁仪器厂;800 型低速离心机:常州市国华仪器厂;JA2003 电子天平:上海良平仪器仪表有限公司;汽浴恒温振荡器;高速冷冻离心机;真空冷冻干燥机。1.2 方法1.2.1 斜面培养。将供试的黑曲霉菌株在无菌条件下接入斜面培养基(即马铃薯培养基),30 左右培养72 h。1.2.2 种子培养。把斜面菌株接入装有50 m l 培养基,并经121 灭菌20 m in 的种子培养基(250 m l 三角瓶)中,30 左右振荡培养48 h。1.2.3 产酶液体发酵。将经培养后的种子培养基中的菌体按10%的接种量接入到装有50 m l 培养基,并经121 灭菌20 m in 的发酵培养基(250 m l 三角瓶)中,30,汽浴恒温培养箱转速140r/m in,振荡培养96 h,而后在4 000 r/m in 离心10m in,收集上清液,测定其酶活力。1.2.4 固态发酵培养。称取10g 麸皮加入500 m l 三角瓶中,安徽农业科学,Jou rn al o f Anhu i Agri.Sci.2008,36(3):860-862 责任编辑 李菲菲 责任校对 李菲菲再加入20 m l 水,摇匀使麸皮 全部湿润,121 灭菌20 m in。冷却后,用接种环将斜面培养基上的菌体接入,30 左右培养8 d 后,用pH 值4.8 的醋酸缓冲液100 m l 浸泡2 h,过滤、离心,收集上清液,测定其酶活力。1.3 酶 活力测 定 葡萄 糖标准 曲线的 绘制:分别吸 取10m g/m l 葡萄糖标准贮备溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m l 于试管中,用蒸馏水加至1 m l,再加1 m l DN S 试剂,充分混合后在沸水中煮沸5 m in,冷却后用蒸馏水稀释至10 m l,在540 nm 波长处测定其吸光值。取0.5 m l 一定稀释度的样液,加入0.5 m l 0.5%的水杨苷(溶解于0.1 m ol/L pH 值4.8 的醋酸缓冲液中),55 保温20 m in,加入1 m l DNS 试剂,充分混合在沸水中煮沸5 m in,冷却后用蒸馏水稀释至10 m l,在540 nm 波长处测定其吸光值,以加热灭活的酶液按照同样方法处理作为空白。定义每小时由底物产生1 m ol 还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活单位(U)。1.4 黑曲霉产酶条件优化 通 过对不同碳源、氮源、无机盐、初始pH 的选择和研究,进而对黑曲霉产-葡萄糖苷酶的条件进行优化。1.5 硫酸 铵 分级 沉 淀 盐析 缓 慢向 100 m l 样 液中 加 入(NH4)2SO4至35%饱和度,同时不断搅拌,静置过夜,保持4,转速15 000 r/m in 离心分离,弃去沉淀,收集上清液。然后向上清液中添加(NH4)2SO4至75%饱和度,静置过夜,保持4,转速15 000r/m in 离心分离,弃上清液,收集沉淀。1.6 真空冷冻干燥 将经盐析处理过的样品,在真空冷冻干燥机上直接进行真空冷冻干燥,得到粗酶制剂。1.7 -葡萄糖苷酶性质研究 对-葡萄糖苷酶的反应液浓度、反应温度、反应pH 进行分析研究,测定其性质。2 结果与分析2.1 产酶菌株的筛选 分别以黑曲霉3.316、黑曲霉3.4523、黑曲霉1、黑曲霉2、黑曲霉3 为供试菌种,经过培养后测定酶活力,黑曲霉3.316 的酶活最高(90.45 U/m l),其次为黑曲霉3.4523(76.77 U/m l),黑 曲霉1、2、3 依次 为45.32、52.18 和23.34 U/m l。因此笔者选用黑曲霉3.316 为出发菌株。2.2 葡萄糖标准曲线的绘制 以浓度(C)为横坐标,吸光值(OD)为纵坐标,得标准曲线方程:y=1.183 7x-0.030 1,R2=0.997 6(图1)。图1 葡萄糖标准曲线F ig.1S trandardcu rve o f g lu co se2.3 液体发酵培养基及发酵条件的优化2.3.1 不同碳源对黑曲霉产酶的影响6。研究不同碳源,在相同碳源浓度(2%)及相同发酵条件下对-葡萄糖苷酶活力的影响(图2)。由图2 可见,不同碳源产酶相差较大,表明碳源差异对产酶有较大影响。麸皮做碳源时产酶最高。图2 不同碳源对-葡萄糖苷酶活力的影响F ig.2 E ffe c t o f d ifferen t c arbonsou rc e s on a c tiv ityo f -g lu co sida se2.3.2 不同氮源对黑曲霉产酶的影响。由图3 看出,氮源种类及浓度对产酶有影响,当以0.1%蛋白胨为氮源时,产酶活力最高,但太高浓度的蛋白胨对产酶无益。图3 不同氮源对-葡萄糖苷酶活力的影响F ig.3 E ffe c t o f d ifferen t n itroge nsou rce s on a c tiv ityo f -g lu co sidase2.3.3 无机盐对黑曲霉产酶的影响。由图4 可见,培养基中含0.1%KH2PO4时,黑曲霉3.316 产酶最高,所以培养基中选择加0.1%KH2PO4。图4 不同无机盐对-葡萄糖苷酶活力的影响F ig.4 E ffe c t o f d ifferen tin organ icsa lt on a c tiv ityo f -g lu co sida se2.3.4 培养基初始pH 值对黑曲霉产酶的影响。pH 值会影响细胞表面带电基团的解离及其微观结构,进而影响营养物的吸收及代谢分泌,导致微生物的生长和代谢发生变化。该研究调节不同的初始pH 值,并进行发酵试验。图5 表明,当发酵培养基起始pH 值为6.0,酶活力最高。2.3.5 优化试验。由上述单因素试验可知,碳源、氮源、无16836 卷3 期 朱凤妹等 -葡萄糖苷酶产生菌的选育及其性质研究图5 不同初始pH 值对-葡萄糖苷酶活力的影响F ig.5 E ffec t o f in itia l pHva lu esa lt onac tiv ityo f -g lu co s ida se机盐、初始pH 值对黑曲霉产-葡萄糖苷酶有较大影响。因此设计了4 因素3 水平正交试验(表1、2),以确定最佳液体发酵培养基中各组分的浓度及配比。表2 显示,4 因素对-葡萄糖苷酶活力的影响与单因素试验结果基本相同。由极差分析可得,各因素对-葡萄糖苷酶活力的影响大小为:AB D C,可见碳源对酶活力影 响最大。试验得出最 优组合:A2B2C3D1,即当培养基中麸皮浓度为4%,蛋白胨0.1%,KH2PO40.1%,初始pH 值6.0 时,产酶最有利。表1 正交试验因素、水平T ab le 1Fac to rs an dleve lsinorthogon a l te s t水平L eve lsA 碳源麸皮%B ranascarbonsou rceB 氮源蛋白胨%P ep tone asn itrogen sou rceC 无机盐KH2PO4%Ino rgan icsa ltD 初始pH值In it ial pHvalue140.05 06.0220.100.057.0310.200.107.5表2 L9(34)正交试验设计及结果分析T ab le 2 D e signo f orthogon a l te s t L9(34)an dre su lt an a ly s is序号N o.A 碳源C arbonsou rcesB 氮源N itrogensou rcesC 无机盐In organ icsa ltD 初始pH值In itia l pH 值va lue酶活力(OD 值)En zym e activ ity(ODva lue)111110.103212220.623313330.167421230.425522310.982623120.520731320.264832130.114933210.148K10.8930.7920.7371.233K21.9271.7191.1961.407K30.5260.8351.4130.706k10.2980.2640.2450.411k20.6420.5730.3990.469k30.1750.2780.4710.235R0.4670.3090.2260.2342.4 固态发酵 有报道称用麸皮固态培养比液态培养效果好,也有报道说固态培养酶活力远高于液态培养。由于固态发酵的培养基一般只需要麸皮,成本较低。所以该试验以黑曲霉3.316 为-葡萄糖苷酶产生菌进行固态发酵,发酵8 d后,所测定得到酶活力,远高于用其他菌株或其他条件发酵产生的-葡萄糖苷酶的酶活力。2.5 -葡萄糖苷酶粗酶制剂的制备 经盐析后的粗酶液,在真空冷冻干燥机上进行冷冻干燥后,得粗酶粉,称固形物的重量及总蛋白含量,再测粗酶粉的酶活力,得该酶制剂的酶活力单位为105.54 U/m g。2.6 -葡萄糖苷酶的特性分析2.6.1 反应液浓度对酶反应活力的影响。把-葡萄糖苷酶粗酶制剂溶解在不同浓度的醋 酸缓冲液(0.05、0.10、0.20、0.40 m ol/L)中,测 定 波长 540 nm 处吸 光 值分 别 为 0.169、0.412、0.236 和0.112。由此可知,该酶的最佳反应液浓度为0.1 m ol/L 醋酸缓冲溶液。2.6.2 酶反应最佳温度的测定。把-葡萄糖苷酶样液在40、50、55、60、65 分别保温测定波长540 nm 处吸光值,结果分别为0.132、0.225、0.547、0.323 和0.110。由此可得,该酶反应的最适温度为55。2.6.3 酶反应最佳pH 测定。把-葡萄糖苷酶粗酶制剂分别溶入pH 值4.4、4.6、4.8、5.0、5.2 的醋酸缓冲溶液,测定波长540 nm 处 吸 光 值 分 别 为 0.012、0.231、0.432、0.548 和0.213。由此可知,在pH 值5.0 时,酶活最高,因此该酶最佳反应pH 为5.0。3 结论该试验得到一株-葡萄糖苷酶高产菌株黑曲霉3.316。产酶 的最 佳工 艺 条 件为:麸 皮 2%,蛋 白 胨0.1%,KH2PO40.1%,初始pH 为6.0。测得酶活力为152.20 U/m g。-葡萄糖苷酶性质:在0.1 m ol/L 醋酸缓冲液中酶活力最高,最佳反应温度为55,最佳反应pH 值为5.0。参考文献 1 CHAN ZY H,H ENR IS SA T B.T he actionof 1,4-D-g lucan ce llobioh yd ro lase onvalon iacellu lo se m icrocrya ta l:an electronm icroscop ic stud y.J F EBS L e tter,1983,153(1):113-117.2 闫会平,陈士华,吴兴泉.黑曲霉-葡萄糖苷酶的研究进展 J.纤维素科学与技术,2007,15(1):59-63.3 刘小杰,何国庆,陈启和,等.黑曲霉-葡萄糖苷酶发酵培养基的优化J.中国食品学报,2006,6(2):6-10.4 纤维素酶制剂 S.QB 2583-2003.5 沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验 M .北京:高等教育出版社,2001.6 M AN D EL S M,RE SSE SET.Indu ctionof ce llu laseintricho le rm av irid e asin flu-en ced bycarbon sou rces and m e talJ.J B acteriology,1957,73(2):269-278.科技论文写作规范 讨论着重于研究中新的发现和重要方面,以及从中得出的结论。不必重复在结果中已评述过的资料,也不要用模棱两可的语言,或随意扩大范围,讨论与文中无多大关联的内容。268 安徽农业科学 2008 年