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家族性与散发性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性研究
【摘要】 目的： 通过聚合酶链式反应、基因测序技术及TDIFP技术，检测散发性与家族性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性，探讨Parkin基因突变在PD发病机制中的作用，同时建立一种新的突变检测方法.方法: 以36例家族性及114例散发性PD患者为实验对象，150名正常健康人为阴性对照，通过PCR扩增含Parkin基因4号外显子的DNA片段，电泳分析初次筛选片段缺失者.基因测序技术对无缺失片段进行克隆、测序，筛选出突变型及野生型.最后应用TDIFP技术检测R110或TAMRA标记ddNTP的FP值，鉴定Parkin基因4号外显子的基因点突变型.结果: 在36例家族性PD患者中共发现10例4号外显子缺失突变，占27％，点突变有4例，占11%；114例散发性PD患者中仅有2例4号外显子缺失突变，占1%，而点突变则有48例，占42%.150例阴性对照组中无缺失突变，点突变10例，占6%.结论: Parkin基因突变可能是PD发病的重要因素之一，而散发性与家族性帕金森病具有不同的突变类型，可能与其具有不同的发病机制相关联.
　　【关键词】 帕金森病；基因，突变；外显子
　　0引言
　　Parkin基因是目前研究发现与帕金森病发病密切相关的遗传易感基因之一，该基因包括12个外显子，有多处突变，其中以4号外显子为主，该外显子处于Parkin基因的突变热点区域.对该外显子的突变规律的研究对于揭示PD的遗传学特性具有重大指导意义.
　　1资料和方法
　　11临床资料实验组PD患者150，平均年龄岁，平均发病年龄岁.包括36例家族性及114例散发性PD患者均为1999-02/2003-06我科住院接受苍白球或丘脑毁损手术的患者，符合第一届全国锥体外系会议制订的PD诊断标准.全部病例均无血缘关系.具有家族遗传病史的患者中母系遗传16例，源自父系14例，同时有母系和父系家族史者2例，无法判明是母系还是父系4例.全部实验组中早发型PD 40例.对照组150例系门诊健康查体者，排除锥体外系及其他神经系统变性疾病，其性别及年龄分布两组间无显着性差异.
　　1 2方法
　　121提取基因组DNA抽取患者及对照组肘静脉血2 mL，加05 mL的20 mL/L EDTA抗凝，应用ReadyPCRTM(华美公司生产)全血基因组DNA纯化系统提取全血基因组DNA.
　　122目标DNA片段的提取应用PCR扩增技术对Parkin基因4号外显子进行扩增.从Medline查Genbank，参照Parkin基因的序列，应用DNA Star软件设计exon 4引物.上游引物序列为： 5′TGCAGCATTATTAGCCACTTCTT3′，下游引物序列为： 5′TTCGGCTATCATTAACTATCACAA3′.反应体系为： MgCl2、dNTPS、10×buffer 各25 μL，P1和P2各1 μL，Taq聚合酶1单位.加水补足25 μL.反应条件为94℃变性10 min；55℃退火30 s，72℃延伸30 min； 进行40个循环， 72℃延伸10 min.取5 μL PCR扩增产物在15 mL/L琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色、显带，观察条带缺失情况.
　　123基因测序分析分别对家族性、散发性及阴性对照组中未出现exon 4缺失突变的PCR扩增序列5例进行分子克隆，方法： 对DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收，与T载体连接，体系 T载体1 μL，目的片段4 μL，solutionⅠ5 μL16 ℃1～4 h.转化大肠杆菌DH5a 涂Amp＋ 板子.挑单克隆，37 ℃摇匀过夜提质粒.酶切鉴定.送上海博雅生物技术有限公司对其DNA进行测序，筛选出阳性对照及阴性对照.
　　124突变位点的SNP测定应用TDIFP技术，测定Parkin基因4号外显子的601位GA的突变.参考国外文献的上下游碱基引物序列，确定SNP引物5′CGGGAAAACTCAGGGTACAGTGCA3′进行突变位点的末端碱基荧光偏振插入，确定突变碱基类型.微孔板每孔加入5 μL PCR扩增产物，加入2 μL 1×PCR消化酶，37℃反应1 h，清除游离的PCR引物P1和P2及dNTPs；80℃水浴15 min，失活PCR消化酶.随后每孔加入13 μL AcycloPrimeFP混合物.方法： 将微孔板置于热循环仪，95℃预变性2 min，95℃ 15 s， 63℃ 30 s，共25个循环；室温15 min.微孔板在wallac 1420、 VICTOR2TM1420 multilabel counter上分别检测R110和TAMRA的FP值.
　　2结果
　　21初次PCR扩增结果在36例家族性PD患者中共发现10例4号外显子缺失突变，占27％，114例散发性PD患者中仅有2例4号外显子缺失突变，占1%， 150例阴性对照组中无缺失突变.
　　图1Parkin基因第4号外显子PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析　略
　　图2G601-A TDI-FP检测结果　略
　　22TDIFP检测Parkin基因4号外显子突变检测，36例家族性PD患者中发生601位点GA突变型有4例，占11%；114例散发性PD患者中发生601位点GA突变型则有48例，占42%.150例阴性对照组中601位点GA突变型10例，占6%.
　　23基因测序分析Parkin基因4号外显子的PCR产物与T载体重组克隆扩增后，送上海博雅生物技术有限公司对其DNA进行测序，结果显示，15例基因测序结果与TDIFP检测的601位GA突变型及野生型结果完全一致.
　　3讨论
　　PD的发病机制迄今尚未完全明确，目前认为是遗传因素与环境因素共同作用的结果.有证据表明，长期接触锰、有机氯等化学物质的人帕金森病患病率高，吸毒人员吸食MPTP引起与帕金森病相同的神经病理变化和临床表现.因此，环境毒素在体内蓄积对神经元的破坏引起帕金森病的假设得到了多数学者的认同.但近年来随着基础研究的日益深入，遗传因素在PD发病中的作用日益引起人们的关注，因为单纯环境因素无法解释为什么人群中许多具有相同环境暴露的个体并不都患病，提示个体存在对帕金森病易感性的差异.
　　遗传易感性是由遗传易感基因决定的，目前发现与PD发病相关的基因有多种，但Parkin基因是研究证实与PD发病确切相关的基因之一.该基因位于第6号染色体长臂的252～27区，位于遗传标记D6S305和D6S253之间［2］.与帕金森病的常染色体隐性遗传有关.整个基因长度有5 000 000 bp，是迄今发现最长的遗传基因，包括12个外显子，其核心编码区为2960 bp的核苷酸序列构成，其中含有一个1395 bp的开放阅读框架，编码一个包含有465个氨基酸的蛋白质，即Parkin蛋白.该蛋白具有两个环指样结构和一个泛素结构域，核心区域包括3～7个外显子，编码具有76个氨基酸的多肽，可与细胞蛋白共价结合，形成一个分枝多聚泛素链，与26降解的蛋白片段相连接，形成淀粉样沉淀物.Parkin蛋白在泛醌水解酶E3和UbcH7、UbcH8中起重要作用.而其他与PD发病相关的基因如a－共核蛋白基因等所编码的蛋白也是Parkin蛋白的靶蛋白之一.Exon 4位于Parkin基因核心编码区中的514～635 bp之间，共122 bp.编码Parkin蛋白氨基酸序列138～178位.目前研究发现其601位碱基G→A的突变，可引起Parkin蛋白氨基酸167位丝氨酸S→天门冬酰胺(AAC) N的改变，进而影响蛋白质的一、二级结构和功能的改变.
　　PD按遗传发病形成可分为家族性与散发性两种，家族性PD约占PD总数的10%～15%左右，具有明显家族遗传倾向，而散发性PD则占PD的绝大多数，无明显遗传倾向，但表现为某种遗传易感性，目前认为家族性PD与散发性PD可能有不同的发病机制，家族性PD被认为是遗传基因的缺陷所致，可能仅有某些基因异常就可引起该病.而散发性PD则被认为是遗传易感性与环境因素共同作用的结果.具体结合Parkin基因exon4，Parkin基因的突变分为突变缺失和点突变，家族性PD主要表现为exon4的部分或全部缺失，，而散发性PD则主要表现为exon4的点突变.易感基因的热点突变，可引起Parkin蛋白一、二级结构改变，进而影响其功能.最终导致多巴胺能神经元内蛋白水解通路障碍，细胞内淀粉样物质沉积，导致神经元死亡.
　　研究表明Parkin基因外显子的突变并非青少年型PD所特有，而且点突变是比缺失突变更多见的疾病表型，这与PD的临床发病规律相吻合.散发性PD占PD的绝大多数，其发病机制涉及到氧化应激、遗传易感、环境因素、线粒体缺陷等多种因素.目前对于散发性PD的遗传易感基因的研究主要集中在线粒体及其相关解毒酶，除了已经证实的解毒酶CYP2D6B、P4502D6L为PD易感基因外，目前关于散发PD相关核DNA的研究，发现有Mn超氧化物歧化酶的功能异常.该酶功能异常直接导致氧化应激反应异常,最终导致PD患者脑内黑质多巴胺能神经元的变性坏死.而研究发现Mn超氧化物歧化酶基因位于Parkin基因的转录起始部位，其功能与Parkin基因密切相关.
　　我们采用TDIFP技术(即膜板指导的荧光染料终止物掺入反应荧光偏振检测技术 template directed dyeterminator incorporation with fluorescence polarization detection)是检测单核苷酸多态性的重要方法，其是以FP为基础，当荧光素分子被平面偏振光激发时，会在固定的平面发射出与其分子量成正比的偏振荧光.如果荧光素分子量较小，在溶液中自由旋转的速度较快，他会向各个方向发出发射光，荧光偏振不能保持.但当荧光素分子量较大时，其旋转速度就会减慢，其在特定时间内向同一方向发出发射光，荧光偏振就会保持下来.通过测定荧光素分子的FP(单位为Mp)，就可以知道加入的ddNTP的种类，推断出突变位点的核苷酸的类型.这种技术具有非常高的特异性和敏感性，操作简便、费用低，可实现自动化控制，因此在基因多态性研究方面具有广泛的发展前景.
　　遗传因素是帕金森病发病的重要因素之一，Parkin基因则是PD的最主要的易感基因，但其在家族性PD与散发性PD中表现出不同的突变类型，具有不同的遗传特性，这既与PD的临床发病规律及表现类型相吻合.同时又说明了PD发病机制的复杂性.而TDIFP技术是检测单核苷酸多态性的较为快捷、准确的方法之一.
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