小鼠哮喘模型肺组织中STAT1活性变化及其对ICAM.docx

小鼠哮喘模型肺组织中STAT1活性变化及其对ICAM1表达的影响
【摘要】　目的 探讨信号转导和转录激活子1DNA结合活性在小鼠哮喘模型的肺中不同时间点的变化及其对细胞间黏附分子1表达的调控作用。 方法　用鸡卵白蛋白(OVA)抗原溶液腹腔注射致敏,雾化吸入激发制备哮喘小鼠模型，造模后凝胶迁移滞留试验的方法测定病变肺组织中STAT1 DNA结合活性在模型组不同时间点(8 h、24 h、48 h、96 h、7 d)的变化；PCR法测定ICAM1mRNA在上述时间点的表达，设生理盐水对照组。设生理盐水对照组为0 h时间组。结果 造模后肺STAT1明显活化，96 h达到最高峰；ICAM1mRNA与蛋白表达在8 h开始有所增加，96 h达高峰。STAT1 DNA结合活性及ICAM1表达呈高度正相关。对照组则无明显改变。结论 哮喘模型的病变肺组织STAT1 DNA结合活性的持续与异常升高，STAT1参与鸡卵白蛋白诱导的小鼠哮喘的发生和　；ICAM1在模型的不同时间点表达增加，可能受到STAT1调控。
【关键词】　小鼠 鸡卵白蛋白 哮喘 动物模型 转录 黏附分子
　　Abstract:Objective To detect the change of DNAbinding activity of STAT1 in various time and expression of intercellular adhesion molecule1　which　was regulated by STAT1 in the mice model with electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and PCR. Methods Mice were randomized into different groups: asthma group and normal control group. Mice in model group were sensitized by intraperitoneal injection and Al(OH)3 on 0,14 d. On 18,19,20 d,the animals were challenged with 10 g/L OVA aerosol for 20 min.　The　models were divided into 6 groups which were killed at 0 h,8 h,24 h,48 h,96 h,7 d. Activity of STAT1 DNAbinding was detected by electrophoresis mobility shift assays (EMSA) at various time points. Expression of ICAM1 was detected by PCR. Results The binding activity of STAT1 increased with a dynamic curve in experimental groups. It began to increase at 8 h point time and reached to peak at 96 h,then decreased but still keep obviously higher at 7 d versus control group (). Levels of ICAM1 mRNA significantly elevated at 8 h and the peak was at 7 d. Conclusions STAT1 activation is an important factor that may be involved in acute and chronic inflammation development. STAT1 also regulated ICAM1 expression during asthma.
　　Key words:mice; OVA; asthma; animal model; transcription; intercellular adhesion molecule
　　支气管哮喘(bronchial asthma,BA)是一种气道非特异性炎症性疾病,在我国发病率比较高，严重 影响 患者的身心健康和生活质量，给　及家庭造成了严重的　负担。随着 研究 的深入，细胞信号转导途径对哮喘的作用越来越受重视，特别是信号转导和转录激活子1，成为揭示哮喘发病机制的一个新的途径。STAT1是连接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的主要蛋白质，在细胞因子调节　中起着重要作用。本文旨在通过建立小鼠的哮喘模型，研究STAT1在哮喘发病过程中对ICAM1基因的转录调节作用，有助于从基因转录调节的水平寻找哮喘 治疗 的新靶点。
　　1 材料与方法
　　1．1 实验方法
　　实验动物分组 36只6周BALA/C小鼠，购自广东院动物实验中心，体质量10～14 g，合格证号：2005A025。按随机区组设计随机分为6组：生理盐水组，模型组(造模后8 h,24 h,48 h,96 h,7 d 5个时间点处死，各6只)。实验方法：第1日每只小鼠腹腔注射20 μg 卵白蛋白(OVA)和2 mg氢氧化铝〔混合于 mL 磷酸盐缓冲液(PBS)中〕；第 8 天注射10 μg OVA 和1 mg 氢氧化铝。第15 天开始将小鼠置于封闭容器中，给予5% OVA 和 ×PBS雾化吸入激发哮喘发作； 均每日 1 次，每次25 min，连续7 d；造模成功后，按上述时间点处死动物。标本处理：造模后放血处死小鼠，从每时间点组迅速取出肺组织，小部分作HE病理 分析 ，其余部分液氮-70 ℃冷冻保存留待EMSA分析STAT1，RTPCR分析ICAM1 mRNA表达。
　　凝胶迁移滞留试验检测肺组织STAT1核蛋白的提取 从液氮中取出肺组织，隔铝箔纸捣碎。裂解缓冲A液312 μL溶解粉末，0 ℃匀浆10～20次。0 ℃，2 000 r/min，离心15 s。弃沉淀，保留上清液冰浴5 min。0 ℃，5 000 r/min，离心10 s。保留沉淀用裂解缓冲B液104 μL重悬，冰浴2 min。0 ℃，12 000 g，离心15 min。保留上清液，取1 μL用考马斯亮蓝染色法测定核蛋白浓度。其余上清液分装，-70 ℃保存备用。凝胶迁移率变动电泳分析法具体步骤 参考　文献 ［1］。
　　逆转录-聚合酶链反应检测肺组织中ICAM1 mRNA变化 总RNA的提取参照Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行。引物的设计与合成按照文献公布的Genebank上小鼠、βActin和ICAM1 cDNA序列，借助于Primer Premier 生物设计它们各自特异的引物，委托上海博亚生物技术有限公司合成。内参照βActin 扩增片段长度701 bp：正义：5′gccaaccgtgaaaagatga3′，反义： 5′gccaggatagagccaccaat3′。ICAM1 扩增片段长度433 bp：正义：5′aacgacgcttcttttgctc3′，反义：5′ctctggcgg taataggtgtaa3′。RTPCR 采用二步法：第一步逆转录：反应体系为 μL %DEPC灭菌三蒸水中加入总RNA 4 μL,Oligo(dT)18 μL,混匀后在65 ℃水浴中变性10 min,冰浴中再加入5×MMLV RT 缓冲液5 μL,dNTP (10 mmol/L)　μL,50 U/μL RNasin　μL,最后加入200 U/mL MMLV 逆转录1 μL,共25 μL；反应条件42 ℃ 1 h,95 ℃ 5 min。第二步多聚酶链反应：反应体系为三蒸水 μL、10×Ex Taq酶缓冲液 μL、dNTP ( mmol/L)2 μL、对应的一对引物各加μL、cDNA 3 μL、Ex Taq( 5 U /μL) μL，共25 μL。PCR反应参数：首先94 ℃ 5 min进行预变性，接下来进行变性、延伸、退火循环，再72 ℃10 min作最后延伸。琼脂糖凝胶电泳观察结果和像分析：配制1%琼脂糖凝胶，取PCR产物5 μL与6×上样缓冲液1 μL混匀后加入凝胶梳孔5 V/cm电压下电泳30～40 min后。Gel 100凝胶成像系统紫外灯下观察电泳结果和摄影，并用其自带的Quantity 软件进行光密度分析，分别 计算 出ICAM1与βActin的光密度积分值之比作为ICAM1mRNA表达的相对表达量。
　　数据及处理 计量资料用表示，统计软件进行正态性检验(normality test)及方差齐性检验(homogenty of variances test),以P＜为差异有显着性。
　　2 结果
　　各组STAT1 DNA结合活性变化的变化
　　EMSA测定显示生理盐水组的肺组织中STAT1 DNA结合活性较低；造模后8 h开始升高，与生理盐水组相比差异具有显着性；24 h时STAT1 DNA结合活性稍下降；第48 h时又再上升，第96 h时达到最高峰，第7 d时活性有所减弱，但仍高于生理盐水组；经特异性与非特异竞争试验证明，加入50，100倍未标记探针电泳带减弱，而加入非竞争探针对其影响不大。
　　表1 不同时间点的STAT1结合活性变化
　　Tab .1 Activity of STAT1 DNABinding in various time points
　　注：0 h 组即NS对照组；与NS组比：*P＜，**P＜
　　ICAM1mRNA表达变化
　　RTPCR检测结果表明，生理盐水组的肺中少量表达ICAM1mRNA，造模后8 h开始升高，与生理盐水组比较差异有显着性，96 h时达到最高峰，7 d时活性有所减弱，但仍高于生理盐水组。
　　表2 不同时间点ICAM1mRNA表达的变化
　　Results of ICAM1mRNA expression in different time points
　　与0 h组比较:**
　　control； mg/L LPS； mg/L LPS； mg/L LPS； mg/L LPS； mg/L LPS；Line M：Marker
　　图1 不同时间点ICAM1mRNA表达的变化
　　Results of ICAM1mRNA expression in different time points
　　3 讨论
　　支气管哮喘是一种慢性气道非特异性炎症性疾病。随着 研究 的深入,人们越来越重视细胞信号传导转录途径对哮喘的作用。STAT1是连接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的主要蛋白质，在细胞因子调节　中起着重要作用。细胞因子通过 JAK/STAT途径激活STAT而诱导目的基因表达。
　　研究发现在支气管哮喘时存在 STAT信号传导途径的异常，在气道炎症时支气管上皮细胞存在 STAT1途径的上调，同时支气管肺泡巨噬细胞缺乏 STAT1的活化及表达［2］。Hierholzer C等发现与健康对照组比较哮喘患者的气道上皮细胞存在 STAT1的异常活化［3］。李国平等［4］发现哮喘豚鼠气道上皮细胞 STAT1的活化与过度表达与嗜酸性粒细胞聚齐增多密切相关。Sampath D等用电泳泳动度移动 分析 法、免疫沉淀、免疫印迹法研究标准对照组、慢性支气管炎、哮喘组发现上皮细胞 STAT1磷酸化与非磷酸化之比为20∶1,提示哮喘存在选择性支气管上皮细胞 STAT1的活化,并且 Henricks试验认为,支气管上皮细胞 STAT1的选择性活化及过度表达与哮喘病情加重有关［5］。本研究利用EMSA 方法 证实了小鼠哮喘病模型中肺组织存在大量具有DNA结合活性的STAT1，它标志着基因转录的关键步骤已启动。并且与生理盐水对照组相比，其活性明显增高，活性高峰时间为第96小时，7 d时活性有所下降，但与生理盐水组比较差异有显着性。
　　STAT1的激活可产生类似某些细胞因子的作用。哮喘过程中，细胞因子信号传导途径存在异常导致 STAT1的活化。Sampath等［5］研究发现 STAT1的活化导致依赖 STAT1的免疫应答基因表达,包括 ICAM1等异常表达。而且,STAT1活化水平与 ICAM1表达呈正相关。同时,ICAM1的表达异常导致淋巴细胞聚集增多,从而加重炎症反应。黏附分子作为一类介导细胞与细胞间或与基质间相互接触和结合的分子，在各种炎症的发生、　过程中起到关键的作用，从而成为抗感染 治疗 的靶子，也是 目前 哮喘治疗的一个目标。本研究通过RTPCR方法，研究了该模型中ICAM1 mRNA的表达，也发现模型组与对照组中存在明显的差别，在正常对照组很少表达甚至不表达ICAM1，而模型组的表达则明显增加。
　　综上所述，卵蛋白的小鼠哮喘模型STAT1是持续活化，与检测的结果一致，而且活性呈动态的变化过程。ICAM1 mRNA的表达在该模型中也明显增加，其动态变化的过程与STAT1 活性变化有着良好的相关性，提示它的表达受STAT1调控。因此通过阻断STAT1 来治疗哮喘具有 理论 基础，可能有　前景。
【 参考　文献 】
　　［1］ FRIED M G．Measurement of protnDNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay［J］．Electrophoresis，1989，10(5-6)：366-376.
　　［2］ SCHINDLER C W. Series introduction JAKSTAT signaling in human disease［J］.J Clin Invest,2002,109(9):1133-1137.
　　［3］ HIERHOLZER C,KALFF J C,BILLIAR T R,et al. Activation of STAT protns in the lung of rats following resuscitation from hemorrhagic shock［J］.Arch Orthop Trauma Surg,1998,117(6-7):372-375.
　　［4］ 李国平,熊瑛,刘志刚,等.支气管哮喘豚鼠气道上皮细胞信号转导子与转录活化因子1表达及其对气道炎症的调控［J］.中华结核和呼吸杂志,2004,27(5):306-310.
　　［5］ SAMPATH D,CASTRO M,LOOK D C,et al. Constitutive activation of an epithelial signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway in asthma［J］.J Clin Invest,1999,103(9):1353-1361.