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CMV抗体免疫金快速检测试剂盒的开发与初步应用 作者：宋鹏，刘陶，杨浩，韩锋产，陈五岭【关键词】 人巨细胞病毒 Development and primary application of immunogold fastdetection kit for human cytomegalovirus 【Abstract】 AIM: To develop a cheap and easytouse kit based on dot immunogold filtration assay for analysis of antibody of the human cytomlegalovirus in serum. METHODS: With prepared GICA apparatus and colloidal gold which were coupled with SPA, the goldSPA conjugate reacted with human IgG in serum and migrated along the nitrocellose strip on which the branched multiple antigenic peptide of human cytomlegalovirus was immobilized. If the serum contained antiHCMV IgG, there would be a red line on the strip where the branched multiple antigenic peptide of human cytomlegalovirus were immobilized. RESULTS: A total of 120 sera were detected for antiHCMV IgG by GICA and ELISA. The sensitivity and specificity of GICA were % and %. The corresponding rate of both tests was %. CONCLUSION: GICA is a sensitive, specific, simple and rapid assay for detecting antiHCMVIgG in sera.【Keywords】 Human cytomegalovirus;Branched multiple antigenic peptide; golol colloid; enzymelinked immunosorbent assay【摘要】 目的： 开发一种低成本、简单易用的基于免疫金渗滤法的试剂盒，以用于检测分析血清中的巨细胞病毒抗体. 方法： 将用人工合成的人巨细胞病毒(HCMV)抗原表位的线性肽和分支多抗原肽分别划线固定于硝酸素纤维膜上，制成免疫层析检测试纸条，血清中IgG与测试条上金标记物结合后沿硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相抗原结合形成肉眼可见的红色带条并用GICA和ELISA试剂盒对比检测120份血清标本中抗HCMV抗体. 结果： 分支多抗原肽制成的免疫层析检测试纸条的灵敏度为%，特异度为%，两法符合率为%. 结论： GICA检测血清中的抗HCMV抗体特异性强，灵敏度高，简便快速，有广泛应用价值.【关键词】 人巨细胞病毒；分支多抗原肽；胶体金；酶联免疫吸附测定0引言人巨细胞病毒感染的普遍性和严重性已引起医学界的高度重视1. 但HCMV感染时，临床症状变化很大，可随患者年龄、机体状况、感染途径不同而异. 现今实验室检测手段包括ELISA检测患者血清中IgG和IgM，套式PCR技术检测血清HCMV的DNA，RTPCR检测HCMV的mRNA以及病毒培养等，但由于以上方法耗时耗力2，且检测费用较高，不适合在基层临床医疗机构的普及性筛查. 为此，我们采用人工合成的包含HCMV抗原表位的线形多肽以及多抗原肽，采取胶体金免疫层析法3，对HCMV进行快速检测.1材料和方法材料制备型HPLC；核酸蛋白检测仪；激光解析质谱；台式冻干机； 固相萃取小柱；芴甲氧羰基保护的氨基酸； 1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼、1羟基苯并三氮唑；线性多聚赖氨酸、DIEA、三氟乙酸； G10, G25凝胶；乙腈；HCMV ELISA对照试剂盒；氯金酸；葡萄球菌A蛋白(SPA)；点膜器. HCMV质控血清为第四军医大学全军基因诊断技术研究所提供，血清标本从第四军医大学西京医院收集.方法抗原表位设计参照文献4，根据KyteDoolittle亲水性方案预测B细胞表位结果设计合成了HCMVgp55抗原表位序列VTSGSTKD .线性肽的合成将PACPEGPS树脂g用二甲基甲酰胺浸泡30 min，进行活化. 采用对称酸酐法将已经活化的树脂进行第一个氨基酸的连接. 称取待连接的氨基酸 195 mg，加入 mL二氯甲烷DCM和3滴DMF使之溶解，加入1mol/L二环己基碳化二亚胺/N甲基吡咯烷酮 275 mL，磁力搅拌，室温下反应15 min，过滤除去沉淀，蒸发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐. 将对称酐溶于最少量的DMF中，加入到活化的树脂中，摇动1 min，然后加入 mol/L 4二甲氨基吡啶(DMAP)/DMF 460 L，摇动反应90 min，吹去反应液，用10 mL DMF洗涤3次，吹干. 其余7个氨基酸的连接采用原位活化法，将连接有第一个氨基酸的树脂放入反应瓶中，加入300 g/L哌啶/DMF溶液50 mL反应15 min，以脱去芴甲氧羰基保护基团. 取 mmol的保护氨基酸，用1 mol/L DIEA/DMF 5 mL溶解，加入 mmol的TBTU和 mmol的HOBT，预反应1520 min，然后和氨基酸树脂一起反应2 h，吹去反应液，50 mL DMF冲洗3次，吹干.将已合成好全部氨基酸序列的树脂放入裂解容器中. 按照TFA水955的比例配制切割试剂，使用时按25 mL切割试剂与1 g树脂反应的比例进行切割，反应时间为2 h. 将反应液快速倒入150 mL乙醚中，收集沉淀，所用乙醚需预先放在低温冰箱中冷却. 将沉淀重新加蒸馏水溶解，再转移到冻干机中冻干.八分支多抗原肽的合成将赖氨酸作为第一个氨基酸按的方法进行连接. 每次均脱保护15 min以上，偶联60 min. 连接3次，得到八分支多聚赖氨酸骨架，将此支架上的赖氨酸作为合成肽的C端第一个氨基酸，按照方法依次进行八肽的连接.免疫胶体金的制备参照文献5制备成15 nm胶体金后，取100 mL用 mol/L K2CO3调至pH ，在搅拌状态下加入SPA mL,继续搅拌10 min；加入50 g/L牛血清白蛋白BSA 10 mL，继续搅拌5 min. 4， 3000 r/min离心5 min，弃沉淀，上清液以12 000 g离心15 min，弃上清，用20 mL悬浮液悬浮沉淀，以吸水纤维吸附后冷冻干燥4 h，4保存备用.免疫层析试纸条的制备试纸条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成. 吸水纤维部分附着有胶体金免疫复合物；在孔径 m硝酸纤维素膜上用多抗原分支肽和线性肽及1 mg/L人IgG划线宽，分别作为检测线和对照线，晾干，用50 g/L BSA封闭2 h，以 mol/L PBS洗涤3次，干燥后依次粘于白色塑料片上，切成 cm10 cm的试纸条，加干燥剂密封保存.抗HCMV IgG的检测在灭菌试管中加入 mL血清，将试纸条含有免疫金标记物的一端插入血清内静置10 min. 试纸条上出现两条红色条带为HCMV IgG阳性；仅对照线出现一条红色条带为阴性；如无红色条带出现则视为试剂失效. 血清样本的ELISA检测严格按照试剂盒说明书进行. 统计学处理： 对免疫层析试纸条和ELISA试剂盒检测结果进行配对2 检验.2结果包被有线性肽的试纸条大部分无红色条带出现，故取消血清样本测试. 对包被有多抗原分支肽试纸条的检测，20份阴性及20份阳性质控血清检测结果符合率为100%. 随机抽取的120份随机血清样本做层析试纸条检测并和ELISA试剂盒检测结果进行对比，显示两种方法在检测结果上无显着性差异；MCHV IgG检测的灵敏度为%，特异度为%, ronden指数为%，与ELISA试剂盒的符合率为%. 表1层析试纸条的检测结果3讨论包被有线性肽的试纸条在质控血清检测中的失败可能是因为我们使用的硝酸素纤维膜对小分子线性多肽的固化能力弱，在洗涤过程中导致线性肽抗原被洗脱，造成最终试验失败，随后我们用立春红染色实验证实了这一想法. 而人工合成的多抗原分支肽由于具有赖氨酸支架结构，大大减少了线性肽无序聚集时形成的空间位阻，同时分子质量较之提高了810倍，易于固化在硝酸纤维素膜上.巨细胞病毒是一类在自然界中普遍存在但又严格种属特异性的病毒，属于疱疹病毒科. 其中使人类致病的为HCMV. 它在人群中的感染非常普遍，初次感染大多在2岁以下，除少数有临床症状外，通常呈隐性感染. 人感染病毒后，多数可长期带毒成为潜伏感染6. 目前临床诊断感染的“金标准”是细胞培养，但由于其耗费时间长，技术复杂，实验室条件要求高，不能达到快速检测和基层临床医疗机构普及性筛查的要求. 本检测试纸条可以在20 min内得到结果，且具有制备成本低，结果明显易辨，操作简便等诸多优点，适于各级临床医疗机构的应用.【参考文献】1 Griffiths PD, McLZean A, Emery VC, et al. Encouraging prospects for immunization against primary cytomegalovirus infection J. Vaccine, 2001;9:1356-1362.2 Sia I G, Patel R. New strategies for Prevention and therapy of cytomegalovirus infection and disease in solidorgan trans plant recipient J.Clin Microbiol Rev, 2000;13:83-121.3贾晓平. 胶体金免疫层析法和ELISA在HBsAg检测中的方法学评价J. 现代医药卫生，2002;18(6):456-457.Jia XP. Evaluation of gold immunochromatography and ELISA assay for HBsAg detection J. Modern Med Health, 2002;18(6):456-457.4 Nejatollahi F, Samantha J, Hodgetts PJ, et al. Neutralising human recombinant antibodies to human cytomegalovirus glycoproteins gB and gH J. Immunol Med Microbiol, 2002;3:237-244.5韩锋产，闫小君，候瑜，等. 胶体金免疫层析法检测抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A抗体J. 世界华人消化杂志，1999;7(9):743-745.Han FC,Yan XJ, Hou Y, et al. Gold immunochromatographic assay for antiHelicobacter pylori antibody J. World Chin J Digestol, 1999;7(9):743-745.6Revello MG, Gerna G. Diagnosis and manage ment of human cytomegalovirus infection in the mother,fetus,and newborn infant J. Clin Microbiol Rev, 2002;15(45):680-715.