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整合子系统与细菌多重耐药研究进展【摘要】 细菌的多重耐药已成为临床治疗的难题，整合子是携带编码抗生素耐药基因盒的DNA片断，在细菌获得和传播耐药基因方面起着重要作用。本文就整合子及其基因盒的分类、分布、结构、来源、整合子对基因盒的捕获表达、整合子与细菌的多重耐药性关系及多重耐药菌感染的治疗等作一阐述。【关键词】 整合子； 基因盒； 多重耐药 ABSTRACT Multidrugresistant bacterial pathogens have become tough problem in clinical theraphy. Integrons are DNA elements carrying antibiotic resistanceencoding gene cassettes, and play an important role in bacteria capturing and disseminating antibiotic resistance gene. This article reviewed the class, distribution, construction, source of integron and gene cassettes, integron capturing and expressing gene cassettes and the relationship between integron and multidrugresistant of bacteria;the treatment to multidrugresistant of bacteria. KEY WORDS Integron; Gene cassettes; Multidrug resistance 近年来随着抗菌药物的广泛应用，尤其是不合理的使用，细菌的耐药性，甚至是多重耐药开始大量出现，给临床感染性疾病的治疗带来极大困难。病原菌耐药的产生主要是通过自身基因的突变累积，或者在水平方向上获取外源性耐药基因，或者两种机制并存引起的。1989年，Stokes等首次提出了一个与耐药基因水平传播的可移动基因元件整合子(integron)1。整合子是一种基因单位，包括位点特异性重组功能的基因决定簇，在整合酶的作用下能识别并俘获或删除移动性基因盒2，并在位于整合子上游的启动子的作用下得以表达，使细菌具有耐药及多重耐药性。整合子可以通过结合性质粒、转座子、整合型噬菌体在同种和不同种菌属间传播，使细菌的耐药性得以广泛扩散。整合子是细菌尤其是革兰阴性菌多重耐药快速发展的主要原因3。 1 整合子的结构 整合子是保守、可移动的转座子样DNA元件，能捕获和整合耐药基因，形成巨大的多基因座。整合子包括两端的高度保守片断(conserved segment，CS)和中间的可变区(variable region)。可变区含有一个或多个基因盒。整合子含有三个功能元件：位于5端的一个编码整合酶(integrase，IntI)的基因(intI)、一个基因重组位点attI和一个启动子4，5，启动子有P1和P2两种，大多数整合子都含有P1启动子，部分还含有P2启动子。3端的结构因整合子的种类不同而不同。整合子的结构如图1所示。 2 整合子的分类和分布 整合子是根据其整合酶的DNA碱基序列不同进整合子的结构模式图行分类的，整合酶属于酪氨酸整合酶家族，目前发现的整合酶至少有6类，其中对I、II和III类整合子的研究较多，且明确与细菌耐药性有关。 I类整合子 I类整合子在临床耐药菌中最常见6，它与Tn21转座子家族相关，其整合酶基因编码含有337个氨基酸的整合酶。5端有编码整合酶的基因intI1和启动子P1，部分还有启动子P2及基因重组位点attI；3端有3个开放读码框(ORF)，即季铵盐化合物及溴乙锭的耐药基因(qacE1)，磺胺耐药基因(sul1)和功能不明的ORF57，8。大多数I类整合子的5CS相似，3CS存在差异。至今发现I类整合子在革兰阴性菌中广泛分布，包括肠杆菌科中的大肠埃希菌属、志贺菌属、变形菌属等以及非发酵菌中的假单胞菌属、不动杆菌属等。 II类整合子 II整合子与Tn7转座子家族相关，其整合酶基因有缺陷，编码的整合酶IntI2约有318个氨基酸，与IntI1有46%的同源性；在3保守端有5个tns基因，与Tn7的转移有关。现已在肠杆菌属、不动杆菌属和沙门菌中分离出II类整合子。 III类整合子 III类整合子是Arakawa在耐碳青霉烯类抗生素的黏质沙雷菌的质粒上发现的，其编码的整合酶IntI3含有320个氨基酸，与IntI1有61%的同源性9。III类整合子带有编码内酰胺酶的基因盒balIMP，目前在假单胞菌、肺炎克雷伯菌、木糖氧化产碱杆菌等革兰阴性菌中分离出III类整合子10。 IV类整合子 在霍乱弧菌基因中发现的IV类整合子又称为超级整合子(super integron)，其编码的整合酶含有320个氨基酸，与IntI1有%的同源性。IV类整合子中含有179个基因盒，在179个基因盒中至少有216个未知功能的开放读码框(ORFs)11。还没有发现它直接与多重耐药有关。 3 基因盒的结构和种类 基因盒是较小的、可移动的DNA分子，常以环形独立状态存在，只有被整合子捕获并整合到整合子中才能转录。不同基因盒的结构和功能不同，但基本结构为一个开放读码框ORF(通常是耐药基因)和一个短的回文序列attC，它是被整合酶识别的特异性重组位点。最初发现attC位点有59个碱基的片断(59 base element，59be)，故attC位点又称59be。基因盒结构如图2示。基因盒本身没有启动子，必须插入到整合子中在启动子P的作用下得以表达，基因盒总是以相同图2 基因盒结构模式图 方向插入，而且从整合子5端保守片段中的启动子开始转录。多个基因盒可以同时插入到整合子。迄今已报道60多个基因盒，比较常见的基因盒有以下几类。 aad基因编码氨基糖苷类的耐药性 目前至少已发现15种由aad基因编码并传递对氨基糖苷类的耐药性。aad基因又分A和B两类，目前已发现aadA有7个成员aadA1aadA7，aadA1编码对四环素的耐药性，aadA2编码对链霉素和大观霉素的耐药性。aadB基因编码对庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的耐药性。 aac基因编码氨基糖苷乙酰转移酶 aac基因主要表现对氨基糖苷抗生素的耐药，目前主要有aac1、aac2、aac3和aac6，其中aac(3)又可分为aac(3)Ia、aac(3)Ib、aac(3)Ic。最近，Ahmed等在一株河流弧菌的I类整合子中发现了aac3Id12。 dfr基因 dfr基因即二氢叶酸还原酶基因，编码对甲氧磺胺嘧啶类的耐药性。以dfrA1多见，大多以基因盒插入I、II类整合子，还能高频插人到含sul1的I类整合子中表现出更强的对甲氧磺胺嘧啶的耐药性。 编码内酰胺酶和超广谱内酰胺酶(ESBLs)的基因 目前这类基因越来越多的被发现13，14，如blaPSE1、blaCMY2、blaVEB1和blaGES2等，形成对青霉素类和头孢菌素类的耐药。特别是近年发现较多的编码对亚胺培南等碳青霉烯类抗生素耐药的金属内酰胺酶基因，如blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaGIM和blsSIM等。 其它基因盒 cat基因编码氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyltransferases)，对氯霉素耐药；oxa编码苯唑西林酶，对苯唑西林耐药；aar基因介导利福平耐药；ere介导红霉素耐药；qnr介导喹诺酮耐药。 4 整合子对基因盒的捕获和表达 整合子在整合酶的催化作用下，通过识别基因盒的attC位点，可以将游离的耐药基因盒整合到自身的染色体上。在整合的过程中，只有一种方向53，多个基因盒按照同样的方向排列，在整合子的启动子带动下得以表达。捕获过程如图3所示。整合过程可以分为特异性整合和非特异性整合两种。 图3 耐药基因盒的整合过程 特异性整合是将耐药基因盒整合到交换位点attI和attC，耐药基因盒可以自由的被整合或切除。耐药基因盒的表达依赖于整合子5端保守区的启动子，通常包含P1和P2两个启动子。不同整合子中启动子的结构与启动强度有所不同，其中P1是主要启动子。基因盒的表达不仅与启动子的强弱有关，还与距离启动子的远近有关，当基因盒直接位于5保守末端时表达最强，而下游的表达较弱，且同一基因盒整合在不同位点时表达水平不同。原因可能与基因盒59be的结构有关。59be内包含不完全反向重复序列，容易形成茎环结构成为转录终子信号或转录产物的内切信号。但下游表达较弱或不表达的基因盒，在抗生素的压力下，有可能借助整合酶介导的基因重组，插入到强启动子或靠近P1的位置，由低水平表达转为高效表达，耐药水平随之上升。 非特异性整合是将基因盒整合到非交换位点attI和attC，而且整合于非特异性位点的耐药基因盒，一旦整合上就不能够被切下，这对于细菌耐药性的传播和细菌的进化有重要意义。非特异性整合的基因盒的表达依赖于适当方向启动子的存在，在没有适当启动子时不能被表达。 5 整合子系统与细菌多重耐药的关系 大多基因盒都含有对抗菌药物耐药的基因，整合子通过捕获一个或多个耐药基因盒，在启动子的作用下表达对抗菌药物的多重耐药。整合子系统作为一个可移动的基因元件，可位于细菌染色体上，将细菌耐药性传给子代；也可以借助于可移动质粒、转座子在同种或不同种细菌之间水平传播，使细菌的耐药性得以扩散。 近年各国学者通过对不同菌属及不同来源的I、II、III类整合子的检测，发现I类整合子在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌、铜绿假单胞菌等检出率很高，如在荷兰临床分离的大肠埃希菌和沙门菌的I类整合子检出率分别为76%和43%，高于II类整合子的检出率11%和1%，且整合子阳性的菌株表现出明显的多重耐药性15。澳大利亚学者通过对肉牛来源的细菌进行II类整合子的检测发现6种不同的II类整合子，其可变区含有不同的耐药基因，其中一个含有9个功能未知的开放读码框(OFRs)，但不含耐药基因16。Pairano等17检测62株志贺菌，并对21种抗生素耐药情况设计引物进行PCR检测，发现都有I、II类整合子和抗生素耐药基因的存在，II类阳性株都有2214bp的基因异常，并介导对甲氧苄氨嘧啶、链丝霉素、链霉素和大观霉素耐药，提示同一类整合子可携带不同的耐药基因盒，同一个耐药基因可出现在不同的整合子上，整合子可在院内细菌中播散多重耐药。Quintein等18在一株铜绿假单胞菌发现一个含有碳青霉烯类抗生素耐药基因VIM2的I类整合子In100，该耐药基因排在整合子可变区耐药基因盒的第一位，提示可能为新近获得并高效表达对碳青霉烯类抗生素耐药，表明微生物为适应环境，通过整合子系统捕获新的耐药基因盒。Valverde等通19过对一株含有一个新的I类整合子In117的研究发现，不但基因盒之间可以发生融合，整合子也可以发生CR1的重组，携带更多的耐药基因盒，增强了细菌的多重耐药性，再通过质粒或转座子水平传播，使细菌的多重耐药性得以广泛扩散。在欧洲和韩国，人和动物来源的细菌的整合子耐药基因盒的检测发现其含有相同的耐药基因盒，提示耐药的基因盒可以通过食物在人和动物之间传播，尤其是沙门菌属，可能导致细菌的多重耐药性随着食物的流通更加广泛的扩散20，21。 石磊等22通过对暨南大学附属第一医院2004年分离的109株临床菌株的分析显示，所有菌株均表现3种以上抗生素耐药，40%的菌株对9种以上抗生素耐药，%存在整合酶基因，其中5株同时含有I、II类整合子，证实一株细菌可以含有多种整合子；对其可变区的分析表明，这些整合子普遍含有1个以上的耐药基因盒，证明整合子广泛分布于各种菌株中，并介导细菌的多重耐药。研究表明，不同地区铜绿假单胞菌的整合子携带基因盒种类存在显着差异，提示整合子对耐药基因盒的携带可能和当地医疗环境及抗菌药物的使用背景有关23。对南京地区98株铜绿假单胞菌整合子可变区的扩增，其中35株可变区扩增阳性，共发现6种不同结构的可变区，主要含有编码氨基糖苷类、内酰胺类耐药基因，表现出对庆大霉素、卡那霉素、头孢菌素及碳青霉烯类抗生素的耐药，其中有3种为新型基因盒的组合形式：aadA6orfD、aadBblaP1和aadBaac(6)IIablaCARB8。其中aadA62orfD型基因盒检出率最高，占所有基因盒的%(15/35)，是在南京地区PA中流行的一种基因盒组合的形式，介导对氨基糖苷类抗生素的耐药24。阳大庆等研究72株鲍曼不动杆菌显示，整合子阳性株对除亚胺培南、头孢吡肟和头孢哌酮/舒巴坦以外的其它抗菌药耐药率较整合子阴性株存在不同程度的差异25。 6 多重耐药菌的治疗 鉴于整合子在细菌多重耐药性的重要作用，要求临床在抗感染治疗过程中应规范、合理的使用抗菌药物，避免在抗菌药物选择压力下产生新的耐药基因并通过整合子得以扩散。对于多重耐药菌株的治疗，研究显示头孢吡肟、亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、阿米卡星等耐药率相对较低，可以用作多重耐药菌感染的治疗。国外报道亚胺培南和阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦和阿米卡星在体外均有协同和部分协同作用。随着器官移植后免疫抑制剂的使用及重症监护病房呼吸机的应用等，临床泛耐药菌株的检出率较前明显增加，特别是非发酵菌的泛耐药现象更加严重。研究资料显示，多黏菌素可能是目前对泛耐药的铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌最有效的抗菌药物之一，多数患者在指导剂量多黏菌素B /(kgd)治疗条件下全身给药耐受良好，不良反应发生率较低且轻微，且多黏菌素诱导细菌产生继发耐药可能性低26，27。Timurkaynak等研究表明多黏菌素或联合使用其它药物对泛耐药的鲍曼不动杆菌疗效肯定，联合其它类抗菌药物治疗可以增加疗效并可能避免诱导耐药性的产生28。周伯平29等通过对一例泛耐药的铜绿假单胞引起的肺部感染在先、后使用头孢吡肟、亚胺培南、阿米卡星等治疗无效时，使用多黏菌素静脉和雾化吸入治疗33d后患者明显好转，治疗过程中血肌酐一直在正常范围内，未出现严重的不良反应，提示多黏菌素可以作为泛耐药菌的治疗方法之一。 7 结语 整合子系统是近年发现的新可移动基因元件，可以捕获耐药基因，使细菌表现为对抗生素多重耐药，给临床治疗带来极大的困难。整合子本身不能移动，但常作为转座子的一部分或借助可移动性质粒在同种细菌或不同种细菌间播散，造成细菌耐药性的扩大。通过对整合子系统的进一步研究，可以 1 Stokes H W, Hall R M. 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