抗坏血酸对细菌脂多糖引起发育毒性保护作用.docx

抗坏血酸对细菌脂多糖引起发育毒性保护作用
【摘要】 目的 研究抗坏血酸(AA)对细菌脂多糖(LPS)引起宫内胎儿死亡(IUFD)、生长发育迟缓(IUGR)和骨骼发育迟缓的保护作用。方法 实验1：LPS组小鼠于妊娠第15～17d经腹腔注射LPS,LPS+AA组在LPS处理前和/或处理后经腹腔注射给予AA，对照组给予等容量的生理盐水或AA。所有孕鼠于妊娠第18d处死。实验2：LPS组小鼠于妊娠第16d注射LPS，LPS+AA组在LPS处理前和/或处理后经腹腔注射给予AA，对照组给予等容量的生理盐水或AA。LPS处理后6h处死孕鼠。结果 LPS+AA预处理组平均每窝死胎数明显低于单纯LPS处理组，LPS+AA后和预+后处理组平均每窝死胎数与单纯LPS组比较差异无统计学意义；AA预、后和预+后处理均显着抑制LPS引起IUGR和枕骨骨化不全。AA预和后处理均显着抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化，但AA预处理的作用强于后处理。结论 AA预处理通过抑制LPS引起的氧化应激，预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓；AA后处理和预+后处理对抗LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓，但对LPS引起的IUFD无明显保护作用。
【关键词】 细菌脂多糖

　　细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性细菌细胞壁结构中的类脂多糖，广泛存在于人和动物的消化道内〔1〕。LPS引起的胚胎吸收、宫内胎儿死亡(intrauterine fetal death,IUFD)和早产已经得到证实〔2〕。本课题组前期研究发现，母鼠妊娠晚期接触LPS引起胎儿宫内生长发育迟缓(intrauterine growth retardation，IUGR)和骨骼发育迟缓，活性氧(ROS)可能参与了LPS引起的胚胎发育毒性〔3,4〕。抗坏血酸(AA)是重要的水溶性抗氧化剂，本文重点探讨AA对LPS引起小鼠IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓的保护作用。
　　1 材料与方法
　　11 试剂 细菌脂多糖(EschericlSia coli LPS,serotyoe 0127：B8)和抗坏血酸(ascorbic acid，AA)(美国Sigma公司)。
　　12 动物及实验方法 清洁级ICR小鼠(7～8周，雄性30～32g，雌性26～28g)(北京维通利华实验动物公司)。实验前适应性喂养1周(自由饮食，昼夜均衡，温度20～25℃，湿度(50±5)%。交配时，按2∶4(雄∶雌)于21：00合笼，次日7：00检查雌鼠阴栓，查到阴栓者定为妊娠第0d。分2个实验。实验1：孕鼠随机分为单纯LPS处理组，LPS+AA预、后和预+后处理组及对照组，所有孕鼠均于妊娠第15～17d给药。单纯LPS处理组仅注射LPS(75μg/kg，ip)；LPS+AA预处理组孕鼠注射LPS前05h给予AA(500mg/kg，ip)；LPS+AA后处理组孕鼠注射LPS后3h给予AA(500mg/kg,ip)；LPS+AA预+后处理组孕鼠注射LPS前05h和后3h各给予500mg/kg的AA；对照组给予等容量生理盐水或AA。所有孕鼠于妊娠第18d处死，记录活胎、死胎、吸收胎数和流产数，秤量活胎体重，测量身长和尾长，并评价活胎鼠骨骼发育情况。实验2：分组同实验1，每组11只，所有孕鼠均于妊娠第16d给药。单纯LPS组仅注射LPS(75μg/kg，ip)；LPS+AA预处理组孕鼠注射LPS前05h给予AA(500mg/kg，ip)；LPS+AA后处理组孕鼠注射LPS后3h给予AA(500mg/kg，ip)；LPS+AA预+后处理组孕鼠注射LPS前05h和后3h各给予500mg/kg的AA；对照组给予等容量生理盐水或AA。LPS处理后6h处死孕鼠，取母肝、胎肝和胎盘，检测丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平。
　　13 氧化应激水平测定 用Griffith法〔5〕测定组织GSH含量。通过测定脂质过氧化的羰基产物MDA含量反映组织的氧化应激水平，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸反应底物(TBARS)比色法〔8〕。蛋白含量用Lowry法〔7〕测定。
　　14 统计分析 采用SPSS 120统计软件进行方差分析和两样本t检验。
　　2 结果
　　21 AA对LPS引起IUFD的影响 单纯LPS处理组平均每窝死胎数显着高于对照组［(01±11)与(82±20)，P001］，LPS+AA预处理组平均每窝死胎数显着低于单纯LPS处理组［(31±45)与(82±20)，P001］。LPS+AA后处理组(54±63)和预+后处理组(62±52)平均每窝死胎数与单纯LPS处理组(82±20)比较差异无统计学意义(P005)。
　　22 AA对LPS引起骨骼发育迟缓的影响(表1) 母鼠妊娠晚期给予LPS引起胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌(趾)骨骨化不全；AA预处理、后处理和预+后处理均显着抑制LPS引起枕骨、后掌(趾)骨骨化不全。
　　23 AA对LPS引起IUGR的影响(表2) 母鼠妊娠晚期给予LPS显着降低活胎体重、身长和尾长，AA预处理、后处理和预+后处理均显着抑制LPS引起IUGR。
　　表1 AA对LPS引起骨骼发育迟缓的影响
　　注：e枕骨评分：1=正常，4=上枕骨未见骨化点；与对照组比较，a P005，b P001；与LPS组比较，c P005，d P001
　　表2 LPS和AA对宫内胎儿生长发育迟缓的影响
　　注：与对照组比较，b P001；与LPS组比较，d P001
　　24 AA对LPS引起组织MDA水平升高的作用(表3) 母鼠妊娠晚期给予单剂量LPS，母肝、胎肝和胎盘组织MDA水平显着升高(P001)。LPS+AA预处理组母肝、胎肝和胎盘组织MDA水平显着低于单纯LPS处理组(P001)；LPS+AA后处理组胎肝和胎盘组织MDA水平明显低于单纯LPS处理组(P005)，但母肝组织MDA水平与单纯LPS比较，差异无统计学意义(P005)；LPS+AA预+后处理组母肝和胎盘组织MDA水平显着高于LPS+AA预处理组(P001)。

　　表3 AA对LPS引起MDA升高的作用
　　注：与对照组比较，b P001；与LPS组比较，c P005，d P001；与LPS+AA预处理比较，e P001
　　25 AA对LPS引起组织GSH降低的影响 母鼠给予单剂量LPS，母肝、胎盘和胎肝组织GSH含量分别为(225±21)，(370±160)，(124±12)nmol/(mg prot)，显着低于对照组(P001)。AA处理后，母肝、胎肝和胎盘组织GSH水平进一步降低。
　　3 讨论
　　本研究结果显示，母鼠妊娠第15～17d经腹腔给予LPS，平均每窝死胎数显着增加。此外，LPS显着降低活胎平均体重、身长和尾长，并延缓胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌(趾)骨骨化。结果表明，母鼠妊娠晚期接触LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。进一步研究发现,LPS+AA预处理组平均每窝死胎数显着低于单纯LPS处理组，AA预处理显着抑制LPS引起活胎平均体重、身长和尾长下降，并逆转LPS，引起的枕骨骨化不全。这些结果提示，AA预处理明显减弱LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。AA是重要的水溶性抗氧化剂。文献资料证实，AA能直接清除机体产生的氢氧自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O-·2)，预防氧自由基引起的氧化性损伤〔8〕。本研究发现，AA预处理显着抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化。结果提示，AA预处理可能通过清除LPS刺激机体产生的ROS，预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。最近研究发现，AA具有双向作用，在有氧微环境下可通过自氧化反应产生去氢抗坏血酸负离子自由基(A-·)、O2-·和过氧化氢(H2O2)〔9〕，过多摄入AA或机体处于有氧状况下可诱导氧化应激并引起机体氧化性损伤〔10,11〕。本研究结果显示，AA后处理和预+后处理对LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化的拮抗作用显着弱于AA预处理。进一步观察发现，AA后处理和预+后处理显着减弱LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓，但对LPS引起IUFD无抑制作用。综上所述，AA预处理通过抑制LPS引起的氧化应激，预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓；AA后处理和预+后处理显着减弱LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓，但对LPS引起IUFD无抑制作用。
【参考文献】
　　〔1〕 Romero R,Espinoza J,Mazor　endometrial infection/inflammation explain implantation failure,spontaneous abortion,and preterm birth after in vitro fertilization［J］
　　.Fertil Steril,2004,82:799-804.
　　〔2〕 Rivera DL,Olister SM,Liu X,et 10 attenuates experimental fetal growth restriction and demise［J］.FASEB J,1998,12:189-197.
　　〔3〕 Chen YH,Xu DX,Wang JP,et　protects against lipopolysaccharideinduced intrauterine fetal death and growth retardation in mice［J］.J Pineal Res,2006,40:40-47.
　　〔4〕 Xu DX,Chen YH,Wang H,et　of Nacetylcysteine on lipopolysaccharideinduced intrauterine fetal death and intrauterine growth retardation in mice［J］.Toxicol Sci,2005,88:525-533.
　　〔5〕 Griffith　of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2vinylpyridine［J］.Anal Biochem,1980,106:207-212.
　　〔6〕 Ohkawa H,Ohishi N,Yagi　for lipid peroxidation in animal tissues by thiobarbituric acid reaction［J］.Anal Biochem,1979,95:351-358.
　　〔7〕 Lowry OH,Rosebrough N J,Farr AL,et　measurement with the Folin phenol reagent［J］.J Biol Chem,1951,193:265-275.
　　〔8〕 Sen Gupta R,Sen Gupta E,Dhakal BK,et　C and vitamin E protect the rat testes from cadmiuminduced reactive oxygen species［J］.Mol Cells,2004,17:132-139.
　　〔9〕 Paolini M,Pozzetti L,Pedulli GF,et　nature of prooxidant activity of vitamin C［J］.Life Sci,1999,64:PL 273-278.
　　〔10〕 Harreus U,Baumeister P,Zieger S,The influence of high doses of vitamin C and zinc on oxidative DNA damage［J］.Anticancer Res,2005,25:3197-3201.
　　〔11〕 Li SD,Su YD,Li M,et mediated Hemolysis in Erythrocytes:Effects of Ascorbic Acid and Glutathione［J］.Acta Biochim Biophys Sin,2006,38:63-69.