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人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建
【摘要】 目的: 克隆人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因全长，并构建其反义真核表达载体. 方法:采用RTPCR法从人膀胱逼尿肌中扩增出β3AR的全长cDNA序列，上游引物5′端加有BamHI及ClaI酶切位点，下游引物加有HindIII酶切位点，将该片段插入pUC18载体中，摇菌扩增后，用ClaI和HindIII切下目的基因，然后将目的片段反向插入逆转录病毒表达载体pLNCX上. 最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定. 结果：经琼脂糖凝胶鉴定，所克隆的目的基因大约为 kb，并成功地连接到逆转录病毒载体pLNCX上，经测序证明，插入的目的片段其碱基序列与Genbank上报道的完全一致，且插入载体的方向完全正确. 结论：成功克隆了人逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的全长cDNA序列和构建了其反义真核表达载体.
　　【关键词】 受体; 肾上腺素能β3; 载体
　　0引言
　　膀胱逼尿肌活动亢进是下尿路症状的常见原因. 研究发现，肾上腺素能β受体亚型能够介导膀胱平滑肌松弛，对维持储尿过程中膀胱良好的顺应性起着关键作用［1］. 但何种βAR亚型介导逼尿肌松弛，国内外学者还有一定的争论［2-3］. 为进一步探讨βAR亚型在逼尿肌中功能奠定基础，我们拟采用反义基因技术，构建βAR亚型的反义真核表达载体，封闭三种βAR中的任意两个，得到表达单一亚型的细胞克隆，再进一步进行研究，以确定βAR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据.
　　1材料和方法1材料人膀胱逼尿肌标本取自手术中因膀胱癌而行膀胱全切患者标本，取正常组织的膀胱平滑肌约1 g，迅速放入液氮中10 min，再放入-70℃冰箱中保存. pUC19购于Takara公司；逆转录病毒载体plncx购自Invitrogen公司；JM109大肠杆菌感受态菌株购自Takara公司. 限制性内切酶和DNA工具酶BamHI，HindIII，ClaI等内切酶购于华美生物有限公司；RNase和T4DNA连接酶购于Promega公司. Trizol试剂及RNA LA PCRTMKit(AMV)购自大连宝生物公司；QiAquick Gel Extraction Kit购于Qiagen公司；质粒提取试剂盒购自Gibco公司.2方法人膀胱逼尿肌中β2AR全长基因的克隆称取冰冻状态下的膀胱逼尿肌组织约200 mg，采用宝生物公司的Trizol试剂并按使用说明书操作提取总RNA，10 g/L低熔点琼脂糖凝胶鉴定RNA的含量及完整性. 根据Genebank提供的β3AR基因序列采用软件设计如下两对引物，外引物及内引物，应用套式PCR来扩增目的基因.

　　内引物：上游引物F01： 5′CCGGATC CATCGATATGGGGCAACCCGGGAACGG3′, 下游引物R01： 5′AGGAAGCTTTTACAGCAGTGAGTCATTTG3′; 外引物：上游引物F02： 5′TGCGCTTACCTGCCAGACTG3′, 下游引物R02： 5′GCCCTTCCTTCTGCATATCTC3′.
　　其中内引物是针对蛋白质编码区设计的，其上游加有BamHI及ClaI酶切位点，下游加有HindIII位点，使其能反向连接在pLNCX的多克隆位点上. 外引物F02，R02可扩增βAR cDNA第194~1587 bp. 引物由大连宝生物公司合成. 取总RNA 1 μL采用宝生物公司的RNA LA PCRTM Kit(AMV)试剂盒进行RTPCR反应. 取8 μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶跑电泳，并用BIORAD Flus凝胶图像处理系统进行图像分析.β2AR基因反义真核表达载体的构建PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶跑电泳除杂质，并用柱式PCR产物回收试剂盒回收. 回收产物与pUC18克隆载体分别用BamHI和HindIII酶切后在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜连接. 取连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，涂布含有氨苄青霉素、IPIG和Xgal的平板，37℃过夜培养，挑取白色菌落并作标记，通过菌落PCR鉴定阳性重组克隆. 将含有阳性重组质粒的菌落挑入适量LB培养液中，37℃培养过夜，采用Gibco公司的质粒提取试剂盒制备质粒，一部分作BamHI+HindIII双酶切鉴定正确后将其命名为pUCβ3AR；一部分用ClaI+HindIII双酶切后，10 g/L琼脂糖凝胶回收 kb目的基因；随后用ClaI+HindIII双酶切逆转录病毒载体plncx，并用Qiagen公司的QiAquick Gel Extraction Kit后回收plncx经酶切后所产生的载体片段，经T4DNA连接酶连接目的基因及载体片段，摇菌扩增，提取质粒后，用ClaI+HindIII双酶切进行电泳鉴定. 插入片段的碱基序列及其插入方向采用DNA测序方法进行鉴定. 鉴定正确后将β3AR反义真核表达载体命名为pLNCXβ3AR.
　　2结果
　　目的基因克隆反转录产物经PCR扩增，10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示RTPCR结果与预期长度一致.
　　β3AR反义表达载体的酶切鉴定其结果与理论设计完全相符.
　　1: dl2000 marker; 2：β3AR; 3: 阴性对照.
　　图1β3AR目的基因产物的RTPCR检测
　　1: dl2000 marker; 2:pLNCXβ3AR; 3:空白对照; 4:λHindIII marker.
　　图2pLNCXβ3AR反义表达载体的酶切鉴定

　　β3AR载体中目的基因的碱基序列及其插入方向测序结果显示我们所克隆进入plncx的目的片段其碱基序列与Genebank所提供的β3AR的碱基序列完全一致，且插入方向完全正确，表明我们已经成功构建了人膀胱逼尿肌肾上腺素能β3受体基因的反义真核表达载体：
　　TGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAG
　　TTCTGTATGAGACCACTCGGATCCCGCAACAACTCT
　　GTTGATCATTCAAGAGATGATCAACAGAGTTGTTGCT.
　　3讨论
　　反义技术是目前许多领域应用得比较多的一种基因治疗技术，其概念就是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些基因的表达［4］. 反义技术一般分三种方法：第一种是应用阳离子脂质体将反义的寡链核苷酸带入细胞内部，与mRNA结合，将其屏蔽掉.
　　第二种是将反义基因连接到所需的表达载体上，转染细胞后转录出反义RNA，并与靶mRNA互补结合，阻断转录过程，从而最终阻止蛋白的表达. 第三种是核酶，它是一种具有酶切割活性的反义核酸，与相应的mRNA结合后能发挥酶活性将其降解. 我们的实验中应用了第二种方法，即应用逆转录病毒载体重组β3AR反义RNA，成功地构建了β3AR反义RNA的重组逆转录病毒表达载体，以期在基因水平上封闭β3AR的表达，来探讨β3AR亚型在膀胱逼尿肌松弛过程中的可能价值. 在我们的实验中，因为根据相关文献［5］，β3AR无内含子成分，无法针对其中的外显子来构建载体，故此我们选择了以全长的β3AR cDNA序列为模板构建载体，来完成封闭作用.
　　目的基因的获得我们是通过RTPCR的方法. 在实验的最初我们只是基于β3AR的蛋白质编码区设计了一对引物，并根据plncx和pUC19的多克隆位点在上下游设计了三个酶切位点，使其能通过克隆扩增后反向连接到真核表达载体中，应用此对引物进行扩增时，电泳结果在 kb处有微弱亮带(目的基因为 kb)，且周围有很多杂带存在，将 kb泳带切胶回收后，经测序证明不是我们想要的目的基因，分析可能是引物的特异性不高，在β3AR mRNA的其他的位置亦有此引物的结合位点所造成的，故此又以5′上游及3′下游非翻译区为模板设计了一对外引物，先用外引物扩增后，再用带有内切酶的内引物进行扩增，结果得到了 kb的单一片段，保证了反应的特异性.
　　肾上腺素能β受体分为三种亚型，β1，β2和β3. 目前对于肾上腺素能β受体的研究，大多是应用βAR亚型选择性的受体激动剂来研究其在膀胱松弛过程中的作用［6-8］，但其选择性依赖于受体激动剂的特异性，而我们构建βAR亚型的反义真核表达载体，转录出反义的βAR，从基因水平封闭其亚型的表达，然后用非选择性βAR激动剂处理细胞以消除激动剂亲和性和效能差异造成的影响，则更加确切. 我们选用的真核表达载体pLNCX是一种逆转录病毒表达载体，相对于脂质体而言，逆转录病毒载体所介导的基因转移效率极高，最高时可达100%，并且可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体中长期表达，可以使我们能有足够的时间来观察在β3AR其他两种亚型被抑制之后的膀胱平滑肌的各种生物学特性的改变. 而后者往往由于细胞摄入率较低或进入细胞后即被降解而影响其反义抑制效果［9］. 经酶切鉴定和序列分析，本实验所克隆的βAR全长cDNA序列与Genbank上报道的完全一致且插入载体的方向也完全正确，重组病毒载体plncxβAR经双酶切鉴定，释放出 kb的片段，说明βAR逆转录病毒反义真核表达载体已构建成功，这就为下一步βAR亚型功能的研究奠定了基础.
　　【参考文献】
　　［1］ Takeda M, Obara K, Mizusawa T, et al. Evidence for beta3adrenoceptor subtypes in relaxation of the human urinary bladder detrusor: analysis by molecular biological and pharmacological methods ［J］. J Pharmacol Exp Ther, 1999, 288(3):1367-1373.
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　　［3］ Rubinstein R, Shalev M, Nissenkorn I, et al. Effect of exogenous adenosine and its monophosphate on the contractile response to acetylcholine in the human isolated detrusor muscle strips ［J］. J Auton Pharmacol, 1998, 18(2):99-104.
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