DB36T1841-2023土壤3种四环素类抗生素的测定 高效液相色谱—三重四极杆质谱法.docx

ICS 13.020CCS Z 10DB36江西省地方标准DB36/ T 18412023土壤 3 种四环素类抗生素的测定 高效液相色谱-三重四极杆质谱法Determination of three tetracycline antibiotics in soil by high performance liquidchromatography-triple quadrupole mass spectrometry2023 - 09 - 18 发布2024 - 03 - 01 实施江西省市场监督管理局发 布DB36/T 18412023目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 方法原理15 试剂和材料16 仪器和设备27 样品28 分析步骤29 结果计算与表示310 精密度和正确度511 质量保证和质量控制512 废物处理6附录 A（规范性）方法的检出限和测定下限7附录 B（资料性）五家实验室的精密度和正确度汇总8附录 C（资料性）质谱参考条件10参考文献11I前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由江西省生态环境厅提出并归口。本文件主要起草单位：江西省生态环境监测中心，江西省新余生态环境监测中心。本文件主要起草人：赵佳文、乔支卫、彭刚华、张振欣、欧阳涛、高明、刘燕红、曾芳发、敖磊、陈美芬、彭惠琛、肖满成、李晓燕、欧丽。II土壤 3 种四环素类抗生素的测定 高校液相色谱-三重四极杆质谱法1 范围本文件规定了测定土壤中3种四环素类抗生素的测定高效液相色谱-三重四级杆质谱法原理、试剂材 料、仪器设备、样品采集和制备、分析测试和质量控制等技术内容。本文件适用土壤中金霉素、土霉素和四环素的测定，方法检出限和测定下限详见附录A。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。HJ 613土壤干物质和水分的测定重量法HJ/T 166 土壤环境监测技术规范3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 方法原理使用乙腈与EDTA-Mcllvaine缓冲液，经水平振荡提取土壤样品中四环素类抗生素，提取液经冷冻离心后通过固相萃取柱净化，经浓缩后待测，使用高效液相色谱-三重四级杆质谱法，电离方式为ESI(+)， 采用多反应监测(MRM)模式进行测定，采用外标法定量。5 试剂和材料5.1 实验用水：电阻率18Mcm，其余指标应符合 GB/T 6682 中表 1 的一级标准。5.2 盐酸：优级纯。5.3 盐酸溶液：（HCl）=0.5 mol/L。准确量取 4.17ml 盐酸（5.1）用实验室去离子水定容至 100ml。5.4 乙腈：优级纯。5.5 甲醇：优级纯。5.6 甲酸：优级纯。5.7 0.1 %甲酸水溶液：准确移取 1.0 mL 甲酸加入 1000 mL 水中，混匀。5.8 0.1 %甲酸乙腈溶液：移取 1.0 mL 甲酸加入 1000 mL 乙腈中，混匀。5.9 金霉素、土霉素、四环素：有证标准物质含量（99%以上）。5.10 金霉素、土霉素、四环素标准贮备液（100 mg/L）：称取 0.0100 g 金霉素、土霉素、四环素（5.9），用甲醇（5.5）溶解并定容至 100 mL；于 4 冷藏、避光保存，或市售有证标准溶液。15.11 金霉素、土霉素、四环素标准使用液（100 g/L）：移取 100.0 L 金霉素、土霉素、四环素标准贮备液（5.10），用甲醇（5.5）定容至 100 mL。5.12 样品提取液（Mclvaine 缓冲溶液：乙腈=7:3）：称取磷酸氢二钠 27.6 g，柠檬酸 12.9 g，乙二胺四乙酸二钠盐 37.2 g，调节 pH 约等于 2，用水溶解后稀释并定容至 1000 mL；移取 Mclvaine 缓冲溶液350 mL，用乙腈稀释定容至 500 mL。5.13 固相萃取柱：规格为 6 mL/500 mgHLB 柱。5.14 氮气：纯度99.999 %。5.15 石英砂。6 仪器和设备6.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱仪：配有电喷雾离子化源（ESI）或其他等效离子源。6.2 分析天平：精度为 0.0001g。6.3 浓缩装置：氮吹浓缩仪或其他类型的等性能相当的设备。6.4 固相萃取装置：自动或手动，流速可调节。6.5 色谱柱：C18 高效液相色谱柱（规格 2.1 mm100 mm，1.7m）或其他性能相近的色谱柱。6.6 H Y-2A 调速多用振荡器。6.7 高速冷冻离心机。6.8 移液枪：5 L、10 L、20 L、50 L、100 L。6.9 冷冻干燥仪。6.10 涡旋振荡器。7 样品7.1 样品的采集和保存样品采集参照HJ/T166的相关规定执行，采集具有代表性的土壤样品，立即置于棕色磨口玻璃瓶中， 用锡箔纸封口于4条件下冷藏。7d内完成提取，提取液在30d内完成分析工作。7.2 样品的制备7.2.1 土壤的冻干：将采集的样品挑除石块树枝，挖出装入培养皿中并用保鲜膜密封置于冻干机上冻 干 48h 以上，冻干量一般为分析用量的 3 倍以上为宜。7.2.2 干物质含量的测定：按照 HJ 613 测定土壤样品干物质含量。7.2.3 土壤中抗生素提取：称取 2.0 g 冷冻干燥土壤样品于 50 mL 离心管中，加入样品提取液（5.12） 10 mL，置于调速多用振荡器（6.6）中振荡 45 min，在 4500 r/min 条件下冷冻离心 10 min 后收集上清液，重复提取 2 次，然后加去离子水稀释至 200 mL，待净化。7.2.4 净化：依次用 3 mL 甲醇（5.5）、3 mL 0.5 mol/L HCl（5.3）溶液、3 mL 水活化 HLB 固相萃取小柱（5.13），以 5 mL/min 速度将提取液或待净化液通过固相萃取柱，然后依次用 5 mL 5 %甲醇溶液、5 mL 水淋洗固相萃取柱。真空泵抽干萃取柱，保持 30 min，最后用 5 mL 甲醇洗脱，洗脱液在氮吹仪浓缩至小于 1 mL 后，用 1 mL 甲醇定容，涡旋溶解 5 min，过 0.22 m 滤膜后测定。8 分析步骤28.1 仪器参考条件8.1.1 高效液相色谱仪参考条件见表 1 和表 2。表 1 高效液相色谱仪分析条件流动相A：0.1 %甲酸溶液（4.6）B：0.1 %甲酸乙腈（4.7）流速0.2 mL/min柱温30 进样体积2.0 L表 2 梯度洗脱程序时间（min）流动相 A(%)流动相 B(%)0901019010540606595890108.1.2 离子源条件见表 3。表 3 离子源条件离子源电喷雾离子源（ESI），正离子模式毛细管电压4000 V，干燥气体温度：350 ，雾化器压力：35 psi干燥气体流速10 L/min8.1.3 多离子反应监测方式（MRM）具体条件参见附录 C，对于不同质谱仪器，参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。8.2 标准曲线的建立准确移取一定体积的金霉素、土霉素、四环素标准使用液（5.11），用甲醇（5.5）稀释，分别配置 7种不同浓度的溶液，1.00 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L、50.0 g/L、100 g/L、200 g/L、500 g/L标准系列，待测。由低浓度到高浓度依次对标准系列溶液进样，以标准系列溶液中目标组分的响应值为横坐 标，以其对应的峰面积为纵坐标，建立标准曲线。8.3 样品的测定取按（7.2）制备好的待测试样，按照与绘制校准曲线相同的仪器分析条件进行测定。当待测试样浓度超出标准曲线线性范围时，样品使用甲醇稀释后再测定。8.4 空白试验使用石英砂，按照(7.2)进行样品制备，与试样相同的测定条件（8.1）进行空白试样的测定。9 结果计算与表示39.1 定性分析按照附表 C.1确定的母离子与子离子进行监测，试样中目标组分的保留时间与标准样品中该组分的保留时间的相对偏差的绝对值应小于2.5 %；且对待测样品中各组分定性离子的相对丰度（Ksam，见式1）与浓度接近的标准溶液中对应的定性子离子相对丰度（Kstd，见式2）进行比较，所得偏差标准在表4规定的最大允许偏差范围内，则可判定为样品中存在对应的待测物。四环素的总离子色谱图见图1。（1）式中：-样品中某组分定性子离子的相对丰度，%；-样品中某组分二级质谱定性子离子的峰面积；-样品中某组分二级质谱定量子离子的峰面积。（2）式中：-标准样品中某组分定性子离子的相对丰度，%；-标准样品中某组分二级质谱定性子离子的峰面积；表 4 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差图 1 金霉素、土霉素、四环素总离子流色谱图9.2 定量分析9.2.1 土壤样品的计算结果土壤样品中的目标物含量，按照公式（3）计算：4-标准样品中某组分二级质谱定量子离子的峰面积。Kstd %最大允许偏差 %Kstd502020Kstd502510Kstd2030Kstd1050（3）式中：样品中目标化合物含量，g/kg；由标准曲线计算所得试样中目标化合物质量浓度，g/L； 试样定容体积，ml； 稀释倍数；样品称样量，g； 样品干物质含量，%。9.3 结果表示当测定结果大于等于1 g/kg时，数据保留三位有效数字；当结果小于1 g/kg时，保留至小数点后两位。10 精密度和正确度10.1 精密度用5.00 g/kg；50.0 g/kg；200 g/kg低、中、高三个含量金霉素、土霉素、四环素对三个空白样品加标进行精密度测试，结果相对标准偏差为金霉素：5.1 %，3.5 %，3.0 %，土霉素：5.5 %，3.6 %，2.9 %， 四环素：6.6 %，3.2 %，3.3 %。精密度数据汇总表见附录B中表B.1。10.2 正确度五家实验室分别对空白样品加标，加标浓度为5.00 g/kg、50.0 g/kg、200 g/kg进行分析测定。加标回收率范围分别为：金霉素：86.6 % 118 %，82.0 % 112 %，80.5 % 103 %；土霉素:92.8 % 100 %，87.9 % 113 %，93.8 % 102 %；四环素95.4 % 116 %，86.9 % 111 %，79.6 % 118 %。正确度数据汇总表见附录B中表B.2。11 质量保证和质量控制11.1 空白分析每次分析至少做一个空白试验，空白试验中检出目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。11.2 校准11.2.1 每批样品应绘制标准曲线，相关系数 r0.995，否则重新绘制标准曲线。11.2.2 每 20 个样品或每批次样品（少于 20 个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液，其测定结果与该点浓度的相对偏差应25%，否则，需重新绘制标准曲线。11.3 平行样的测定每20个样品或每批次（少于20个样品）需做1个平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应20%。11.4 样品加标回收率测定5每20个样品或每批次（少于20个样品）需做1个基体加标样，加标样与原样品在完全相同的测试条件下进行分析。加标回收率应在70 %120 %之间。12 废物处理实验过程中产生的废液和废物应分类收集和保管，委托有资质的单位进行处理。6附 录 A（规范性）方法的检出限和测定下限表 A.1方法检出限和测定下限（单位：g/kg）序号元素方法检出限测定下限1金霉素 CTC0.20.82土霉素OTC0.20.83四环素 TC0.20.87DB36/T 18412023附 录 B五家实验室的精密度和正确度汇总表 B.1方法精密度汇总表8（资料性）目标化合物实验室内相对标准偏差（%）实验室间相对标准偏差（%）石英砂空白加标量实际样品加标石英砂空白加标量实际样品加标5.00 g/kg50.0 g/kg200 g/kg20.0 g/kg50.0 g/kg200 g/kg5.00 g/kg50.0 g/kg200 g/kg20.0 g/kg50 .0g/kg200 g/kg金霉素 CTC2.89.61.66.11.94.41.7281.67.62.25.111129.0242822土霉素 OTC1.810.02.38.21.74.04.4262.4122.65.43.09.03.07.0127.0四环素 TC1.8111.45.91.84.44.0272.0102.15.88.09.014121910目标化合物重复性限 r再现性限 R石英砂空白加标量实际样品加标石英砂空白加标量实际样品加标5.00 g/kg50.0 g/kg200 g/kg20.0 g/kg50.0 g/kg200 g/kg5.00 g/kg50.0 g/kg200 g/kg20.0 g/kg50.0 g/kg200 g/kg金霉素 CTC0.75.416.80.75.416.81.717.017.311.637.718.7土霉素 OTC0.96.616.40.96.616.40.914.019.63.017.619.0四环素 TC1.15.419.81.15.419.81.513.520.25.317.320.7DB36/T 18412023表 B.2方法正确度汇总表石英砂空白加标元素5.00 g/kg50.0 g/kg200 g/kg加标回收率 P（%）加标回收率的标准偏差（%）加标回收率最终值（%）加标回收率P（%）加标回率的标准差 （%）加标回收率最终值（%）加标回收率 P（%）加标回率的标准偏差（%）加标回收率最终值（%）金霉素CTC100.211100.22295.1995.41894.6994.618土霉素OTC97.8397.8699.8999.81897.3397.36四环素TC102.78102.71697.1997.11896.81496.828实际样品加标元素20.0 g/kg50.0 g/kg200 g/kg加标回收率 P（%）加标回收率的标准偏差（%）加标回收率最终值（%）加标回收率P（%）加标回率的标准差 （%）加标回收率最终值（%）加标回收率 P（%）加标回率的标准偏差（%）加标回收率最终值（%）金霉素CTC100.031006105.09105.018101.35101.310土霉素OTC99.079914102.512102.52494.6594.610四环素TC91.21091.22096.31096.32094.21094.2209DB36/T 18412023附 录 C（资料性） 质谱参考条件表 B.3目标化合物的多离子反应监测条件种类名称母离子（m/z）定量、定性离子（m/z）碰撞电压/V毛细管出口电压/V目标化合物金霉素 CTC479443.9*，153.918，30124土霉素 OTC461.1425.9*，200.914，42118四环素 TC445.1410*，153.914,26122注：带*的为定量离子对10DB36/T 18412023参考文献1 左艳丽毛细管电泳法应用于头孢菌素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素药物的检测D石家庄:河北大学,20122 SPElTINI A,STURINI M,MARASCHI F,et alMicrowave-assisted ex-traction and determination of enrofloxacin and danofloxacin photo-trans-formation products insoilJ Analytical and bioanalytical chemistry,2012,404(5)156515693 刘潇雅,徐源洲,贺南南,等土壤磺胺类抗生素固相萃取高效液相色谱法的构建与 优化J土壤,2019,51(6):112911364 SAlVIA M V,FIEU M,VUllIET EDetermination of tetracycline and flu-oroquinolone antibiotics at trace levels in sludge and soilJApplied and environmental soil science,2015,2015(11):1105 UKASZEWICZ P,BIAK-BIElIN SKA A,DOZ ONEK J，et alA newapproach for the extraction of tetracyclines from soil matrices:Application of the microwave-extraction techniqueJ Analytical bioanalytical chemistry,2018,410:169717076 孟明辉,贺泽英,徐亚平,等QuEChERS 方法结合高效液相色谱串联质谱法同时测定土壤中20 种抗生素J农业环境科学学报,2017,36(8):167216797 PAN l X,FENG X X,CAO M,et alDetermination and distribution of pesticides and antibiotics in agricultural soils from northern ChinaJRSC Adv,2019,9(5):15686156938 陈磊,吴赟琦,赵志勇,等QuEChERS/超高效液相色谱串联质谱法快速测定土壤中19 种氟喹诺酮类抗生素残留J分析测试学报,2019,38(2):1942009 郎朗,狄静波,王戈,等哈尔滨市蔬菜基地四环素类抗生素的污染现状J环境科学 与技术,2018,41(8):15315910 顾云,曹晓云薄层色谱法鉴别土霉素的方法改进J.天津药学,2015,27(1)：12-1411 刘智宏,叶妮,郭文林,等四环素类药物多残留酶联免疫检测方法J中国农业科 学,2009,42(1)：318-32312 孙刚,袁守军,彭书传,等固相萃取-高效液相色谱法测定畜禽粪便中的土霉素、金 霉素和四环素J环境化学,2010 ,29（4）：739-74313 陈小燕,牛玉玲,朱敏,等固相萃取高效液相色谱法测定牛奶中四环素类抗生素J中国抗生素杂志,2017,42(1)：129-13214 梁金玲,黄玉霞,何金兴,等分子印迹固相萃取-高效液相色谱法检测鸡肉中的四环 素类抗生素残留J现代食品科技，2018，,3（7）:224-22915 付珍珍,曾月,李增威,等分子印迹固相萃取高效液相色谱法测定牛奶中四环素类抗 生素残留J浙江农业学报,2018,30（2）：314-32216 孙广大,苏仲毅，陈猛,等固相萃取超高压液相色谱串联质谱同时分析环境水 样中四环素类和喹诺酮类抗生素J色谱,2009,27（1）：54-5817 胡冠九,穆肃,赵永刚,等南京典型县区饮用水源抗生素含量特征J环境化学，2015,34（1）：192-19318 郭欣妍,王娜,郝利君,等超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水、土壤及粪便中25种抗生素J分析化学,2015 ,43（1）：13-2011