通窍活血汤治疗缺血性脑卒中...ET-1、CGRP因子影响_刘黎敏.pdf

59第 2 5 卷 第 2 期 2023 年 2 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.25 No.2 Feb.，2023通窍活血汤治疗缺血性脑卒中的疗效观察及对ET-1、CGRP因子影响刘黎敏，卢昌均，韦冰心，顿玲露，甘艳艳（柳州市中医医院，柳州市壮医医院，广西 柳州 545000）基金项目：国家自然科学基金项目（81760413）；广西自然科学基金项目（2019GXNSFAA245079）；柳州市科技计划项目（2019BJ10611，2020PAAA0610）；广西中医药管理局自筹经费科研课题（GXZYZ20210267）作者简介：刘黎敏（1994-），女，湖南张家界人，硕士在读，研究方向：脑血管病的基础与临床。通讯作者：卢昌均（1963-），男，湖南常德人，教授、主任医师，博士，研究方向：脑血管病的基础与临床。摘要：目的 通过动物实验，探讨通窍活血汤治疗缺血性脑卒中的临床疗效及对ET-1、CGRP因子的影响。方法 实验以48只健康雄性SD大鼠为对象，其中8只大鼠作为假手术组，其余40只用于制备MCAO动物模型。将造模成功的大鼠随机分为4组，模型组及通窍活血汤高、中、低剂量组，每组各8只（排除死亡和不符合标准的模型）。假手术组与模型组灌服同体积的生理盐水，通窍活血汤组按高、中、低剂量灌胃，分别持续灌服14 d，1次/d，给药第14天测定大鼠神经功能情况，并于末次给药后2 h处死。用RT-qPCR法检测大鼠脑组织ET-1及CGRP含量，用TTC染色法观察大鼠梗死情况。结果 与假手术组相比，模型组与通窍活血汤各剂量组血清ET-1表达水平均有所上升（P0.05），脑组织CGRP表达水平有差异（P0.05），呈下降趋势，有统计学意义；与模型组相比，大鼠血清ET-1含量在通窍活血汤各剂量组的表达水平下降（P0.05），脑组织CGRP表达水平升高（P0.05），有统计学意义；与通窍活血汤高剂量组相比，大鼠血清ET-1表达在通窍活血汤中、低剂量组升高（P0.05），脑组织CGRP在通窍活血汤中、低剂量组表达降低（P0.05），有统计学意义，说明通窍活血汤高剂量组比中、低剂量组疗效更优。结论 通窍活血汤治疗急性缺血性脑卒中可能是通过影响血管内皮因子的舒缩功效，发挥对血管内皮功能的保护作用。关键词：缺血性脑卒中；通窍活血汤；ET-1；CGRP中图分类号：R743 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2023)02-0059-05Observation on Therapeutic Effect of Tongqiao Huoxue Decoction（通窍活血汤）on Ischemic Stroke and Its Effect on ET-1 and CGRP FactorsLIU Limin，LU Changjun，WEI Bingxin，DUN Linlu，GAN Yanyan（Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Liuzhou Zhuang Medical Hospital，Liuzhou 545000，Guangxi，China）Abstract：Objective To explore the clinical efficacy of Tongqiao Huoxue Decoction（通 窍 活 血 汤）in the treatment of ischemic stroke and its effect on ET-1 and CGRP factors through animal experiments.Methods 48 healthy male SD rats were selected as subjects，of which 8 rats were used as sham operation group，and the other 40 rats were used to establish MCAO animal model.The successful rats were randomly divided into 4 groups：model group and Tongqiao Huoxue Decoction high，middle and low dose groups，8 rats in each group（excluding death and substandard models）.The rats in the sham operation group and the model group were given the same volume of normal saline，and the rats in the Tongqiao Huoxue Decoction group were given intragastric administration at high，middle and low doses for 14 days，once a day，respectively.The neurological function of the rats was measured on the 14th day，and the rats were killed 2 hours after the last administration.The contents of ET-1 and CGRP in rat brain tissue were detected by RT-qPCR method，and the infarct was observed by TTC staining.Results Compared with the sham operation group，the expression level of serum ET-1 in model group and Tongqiao Huoxue Decoction group increased（P0.05），and the expression level of CGRP in brain tissue decreased（P0.05）.Compared with the model group，the expression level of ET-1 in serum decreased（P0.05）and the expression level of CGRP in brain tissue increased in Tongqiao Huoxue Decoction groups（P0.05）.Compared with the high dose group of Tongqiao Huoxue Decoction，the expression of serum ET-1 increased in the middle and low dose groups of Tongqiao Huoxue Decoction（P0.05），while the expression of CGRP in brain tissue decreased in the middle and low dose groups of Tongqiao Huoxue Decoction（P0.05）.Conclusion Tongqiao Huoxue Decoction may protect vascular endothelial function by affecting the relaxing and contractile effect of vascular endothelial factor in the treatment of acute ischemic stroke.Keywords：ischemic stroke；Tongqiao Huoxue Decoction（通窍活血汤）；ET-1；CGRPDOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2023.02.01360 辽宁中医药大学学报 25 卷缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）临床上又称脑梗死，是由各种因素引起的脑部血管狭窄、梗死导致血管内皮损伤，引起脑组织细胞及神经发生缺血、缺氧、坏死。其主要表现为昏倒、猝然跌倒、半身瘫痪、意识障碍或认知障碍等症状。IS有着高患病率，病后易致残致死，且近年来有研究发现，其发病年龄呈年轻化趋势，给患者及家庭带来了一定的生活与经济压力。血清内皮素-1（endothelin-1，ET-1）与降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是作用于血管内皮上的活性肽细胞，正常情况下，二者相互稳定、平衡；脑缺血时平衡状态被打破，使脑血管处于持续的收缩痉挛状态，导致血管内皮功能障碍，进而加重脑组织的损伤，故血清ET-1与CGRP可作为检测IS病情变化及预后的指标之一，对治疗IS的药物研究有重要意义。通窍活血汤出自清代王清任的 医林改错，是我国经典名方，其原文“治头面，四肢，周身血管血瘀之证”，说明通窍活血汤有着活血祛瘀、开窍醒神、通络的功效，是活血化瘀类代表方。现代研究表明通窍活血汤具有抑制血小板积聚、减轻氧化损伤、减轻脑组织水肿、减缓炎性损伤、改善神经元损伤，对脑神经细胞起保护作用1-4。本实验通过建立大鼠MCAO模型，连续灌胃14 d，通过zea long神经功能评分、TTC染色了解梗死灶情况、检测ET-1与CGRP含量表达，比较不同剂量的通窍活血汤对其治疗效果，并从血管内皮角度探讨通窍活血汤对其作用机制及影响，为通窍活血汤治疗急性缺血性脑卒中提供相应的实验依据。1材料与方法1.1 实验动物选择标准及喂养方法选取健康雄性SD大鼠48只，体质量220250 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供 实验单位使用许可证号：SYXK桂2010-0001，许可证号：SCXK（湘）2019-0014，动物房和实验室温度（223），湿度（555）%，每12 h明暗交替；环境安静，避免强光、噪音等刺激；普通饲料喂养，自由进食饮水。1.2 通窍活血汤的备制通窍活血汤（tongqiao huoxue decoction，THD）具体配伍组成如下：麝香（绢包）0.15 g，赤芍3 g，川芎3 g，红花9 g，桃仁（研泥）9 g，红枣（去核）10 g，老葱（切碎）5 g，鲜姜（切碎）9 g。煎煮方法：用黄酒250 mL，将除了麝香之外的7味药先煎至150 mL，去滓，再放入用绢布包好的麝香，再次煎煮。按大鼠体表系数6.3折算可得等效剂量约6.3 g/kg，并对药物浓度进行定容，计算出每只大鼠每天灌胃所需容量为2 gmL-1d-1。通窍活血汤按高、中、低剂量进行相应稀释：高剂量组（THD 0.72 mL/100 mg+水0.28/100 mL），中剂量组：THD 0.36 mL/100 mg+水 0.64 mL/100 mg，THD 0.18 mL/100 mg+水0.82 mL/100 mg）。1.3 实验所需材料与仪器 MCAO栓线（型号：2541）：平顶山豫顺生物科技有限公司；水合氯醛：天津大茂化学试剂厂；生理盐水：贵州科伦药业有限公司；低速离心机：湖南湘仪集团；高速冷冻离心机：日本Hitachi Koki Co公司；全波长酶标仪：美国ThermoFisherScientific公司；数显示三用电热恒温水温箱：上海跃进医疗器械有限公司；大鼠内皮素-1（ET-1）酶联免疫试剂盒：武汉华美生物工程有限公司；TTC染色液（0.5%）：上海源叶生物科技有限公司；全自动化学发光分析仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TriQuick Reagent总RNA提取液：近岸蛋白科技股份有限公司。1.4 MCAO大鼠模型制备制备大鼠MCAO模型5：颈部备皮消毒，术口位置宜在正中偏右，术口直径约1.5 cm，钝性分离大鼠右侧颈总动脉与迷走神经，寻找颈总动脉分叉处，该过程注意避免损伤迷走神经；再将颈内动脉与颈外动脉分离。具体如下：颈外动脉、颈总动脉近心端用4号线结扎；活结固定颈总动脉远心端，同时动脉夹夹闭颈内动脉，避免进线时出现大出血；线栓进线切口应在距离颈总动脉分叉1 cm处，将栓线缓慢从缺口处插入；松开动脉夹，向上提拉颈总动脉远心端活结，用来固定栓线，栓线的进线深度一般为1718 mm，遇阻力时停止进线，消毒，缝合伤口，术后2 h拔除栓线，消毒，再次将伤口缝合。假手术组只进行颈总动脉与神经的分离，不插栓线。术后放回笼中于室温24 的空调环境下饲养，自由进食、水。观察大鼠神经功能恢复情况，24 h后按经典的Zea longa神经功能评分法评分（5级4分法），评分在13分为造模成功，见表1；或通过观察眼球颜色6：右侧缺血侧眼球小且发暗灰白，左侧与健康大鼠的眼球基本一致；了解造模情况。表1 大鼠Zea longa神经功能评分 单位：分项目评分标准无神经功能缺损症状0轻微神经功能缺损，不能完全展左侧前爪1中度局灶性神经功能缺损，向左侧转圈2重度局灶性神经功能缺损，向左侧倾倒3不能自发行走，意识水平下降41.5 动物分组本实验将大鼠共分5组（排除死亡与不符合标准的模型），分别为假手术组，模型组及通窍活血汤高、中、低剂量组，每组各8只。假手术组和模型组予同容量生理盐水，通窍活血汤各剂量组按相应药物浓度灌胃，连续灌胃14 d，1次/d，并于末次给药2 h后处死。1.6 ELISA定量法检测大鼠血清ET-1含量在实验操作前将试剂盒常温静置30 min，按说明书要求依次对各试剂及血清样品进行稀释，再将各试剂离心600010 000 r/min；按照试剂盒说明书进行加样、37 温箱孵育、洗涤；酶标仪波长设置为450 nm，温度37，在终止反应5 min内测量各孔的光密度（OD值）。以标准品OD值及浓度为横纵坐标，绘制标准曲线的回归方程式，将样本OD值带入公式，计算出样本浓度。血清样本的实际浓度需乘以相应的稀释倍数。1.7 RT-qPCR法检测大鼠脑组织中CGRP含量大鼠处死取脑，对脑组织进行剥离，取病灶侧组织放入EP管中，至-80 冰箱冻存。取大鼠脑组织约50 mg进行研磨，加入1 mL TriQuick Reagent，静置后离心12 000 r/min 4 10 min；取上清加入氯仿61 25 卷 辽宁中医药大学学报 0.2 mL，静置后离心12 000 r/min 4 10 min；取上清加入异丙醇0.5 mL，静置后离心12 000 r/min 4 10 min，弃上清留沉淀；加入75无水乙醇1 mL，静置后离心12 000 r/min 4 2 min，弃液，室温晾干；根据需求加入一定量的无RNA酶水，测定浓度、纯度，定量算好体积后作为模板RNA，进行逆转录提取cDNA。应用逆转录后的cDNA进行RT-qPCR。配置反应体系，每一体系中加入cDNA模板1 L，上下游引物各 1 L，无 RNA 酶水 6.6 L，SYBR 10 L，Rox 0.4 L。三步法PCR扩增程序：95 1 min、循环（3540次），95 20 s、5060 20 s、72 30 s。结果处理采用2CT法。设计CGRP基因及内参Actin基因PCR扩增引物进行检测，引物的设计与序列，见表2。表2 引物的设计与序列引物序列Actin-F：AAGTCCCTCACCCTCCCAAAAGActin-R：AAGCAATGCTGTCACCTTCCCCGRP F：GAGGGCTCTAGCTTGGACAGCGRP R：AAGGTGTGAAACTTGTTGAGGT1.8 TTC染色法了解造模梗死情况大鼠腹主动脉采血后处死，迅速将大鼠放在冰袋上断头取脑，于-20 环境条件下冷冻固定脑组织20 min，行冠状连续切片，片厚1.52 mm。将切片置于2%的TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液中，37 避光孵育20 min，后用4%多聚甲醛固定24 h，拍照。并用IPwin 32软件比较各组大鼠梗死面积像素比，了解各组大鼠梗死区域情况。1.9 统计学处理所有实验均重复3次以上，实验数据先使用Excel表格统计处理，后采用Graphpad prism 8.2进行统计分析，计量资料采用均数标准差（xs）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析（one-anova），P0.05表示差异具有统计学意义。2研究结果分析2.1 大鼠Zea longa神经功能评分比较经过14 d治疗后，通窍活血汤各剂量组大鼠与模型组大鼠进行Zea longa神经功能评分比较发现，通窍活血汤组神经功能评分均较模型组下降（P0.05），提示经治疗后对神经功能均有改善作用，见表3。表3 各组大鼠Zea longa神经功能评分比较（n=8，xs）组别评分/分模型组1.6250.52通窍活血汤高剂量组0.8750.35*通窍活血汤中剂量组1.1250.35*通窍活血汤低剂量组1.1250.35*注：*与模型组比较，P0.05。2.2 各组大鼠血清ET-1水平比较与假手术组相比，模型组与通窍活血汤高、中、低剂量组血清ET-1表达水平均有所上升（P0.05），差异有统计学意义；与模型组相比，大鼠血清ET-1含量在通窍活血汤高、中、低剂量组的表达水平均有所下降（P0.05），差异显著，有统计学意义，提示各剂量组均有治疗意义，见图1。注：*与假手术组比较，P0.05；与模型组比较，P0.05。图1 各组大鼠血清ET-1含量比较2.3 各组大鼠脑组织中CGRP含量比较与假手术组相比，模型组与通窍活血汤各剂量组脑组织中CGRP表达水平均有所下降（P0.05），差异有统计学意义；与模型组相比，大鼠脑组织CGRP含量在通窍活血汤高、中、低剂量组的表达水平均呈升高趋势（P0.05），差异有统计学意义。说明各剂量组均对治疗有效果，见图2。注：*与假手术组比较，P0.05；*与假手术组比较，P0.01；#与模型组比较，P0.05；#与模型组比较，P0.01。图2 各组大鼠脑组织中CGRP含量比较2.4 TTC染色法了解各组造模情况通过TTC染色发现，假手术组无梗死灶，TTC染色脑组织呈鲜红色；而MCAO模型组及通窍活血汤高、中、低剂量组中梗死区脑组织表现为苍白色，未缺血的部分为鲜红色，见图3。注：从左右分别为：假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。图3 TTC染色法了解各组造模情况2.5 IPwin32软件比较各组大鼠梗死面积像素比通过比较各组大鼠梗死面积像素比发现，与模型组相比，通窍活血汤各剂量组梗死区域像素比有不同程度的下降，其中中、低剂量组梗死区域像素比为P0.05，而高剂量组梗死区域像素比为P0.01，差异有统计学意义，提示以高剂量组改善MCAO大鼠脑缺血情况最显著，见图4。62 辽宁中医药大学学报 25 卷 梗死面积像素比注：*与模型组比较，P0.01；#与通窍活血汤高剂量组比较，P0.05。图4 各组大鼠梗死面积像素比较3讨论急性缺血性脑卒中归属中医学中风病范畴，中医认为血瘀与中风存在密切的关系，王清任在 医林改错 载：“中风由气虚血瘀而成”，治疗以活血化瘀为主，其经典代表方为通窍活血汤。方中麝香化瘀通窍，麝香能抑制tMCAO大鼠脑组织基质金属蛋白酶的表达，降低血脑屏障的通透性，改善脑缺血损伤程度7。川芎为血中之气，多项研究证实其提取物能调节血管张力，保护血管内皮细胞功能，抑炎，抗氧化、提升氧自由基的清除力，改善脑循环，减少神经细胞的凋亡，降低MCAO大鼠脑梗死面积8-9。红花是中药活血化瘀类常用药物，陈俊仁等10研究总结提示，在缺血性脑血管疾病中，红花可通过调节血管舒张因子NO的分泌减少血管内皮损伤；通过清除自由基，减轻氧化损伤，或通过抑制IL-6、IL-1等炎性因子的释放，发挥抑制炎症的作用。桃仁既可活血祛瘀，还能润肠通便，其提取物能抑制油抑制TNF-的释放，激发血管内皮活性，从而发挥保护血管内皮、抑制动脉粥样硬化形成的功效11。老葱通窍温阳，葱白提取物可降低缺血性大鼠TNF-和IL-6的表达，以调控炎症递质的分泌，改善氧化应激损伤12。本研究发现，与MCAO模型组大鼠相比，通窍活血汤各剂量组大鼠神经功能均有所改善，尤其以高剂量组效果更明显，提示高剂量组对MCAO大鼠神经功能恢复疗效更显著，可能与通过改善缺血区血流，保护血管内皮相关。内皮素（endothelin，ET）是为活性肽的一种，主要由血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）产生，其他血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）、胶质细胞等也可生成，遍及肺、肾、心、脑、血管等多脏器组织。ET有4种分型，分别为ET-1、ET-2、ET-3、ET-4，其中最为重要的是ET-1。ET-1通过自分泌或旁分泌方法，调控着血管的收缩，促进细胞分裂及VSMC增殖，致使血管壁增厚及重构。CGRP由37个氨基酸组成，是具有强效扩血管作用的活性肽，在心脑血管和神经系统等组织分布较多13。CGRP主要在VECs与VSMC中发挥着舒张血管作用。CGRP作为强血管活性肽，可通过激动其受体或促进VEGF及NO的释放，发挥舒张血管与促进VEC增殖新生的作用。DUAN等14研究发现，CGRP部分通过Ca2+通道、PKC和PKA途径抑制小鼠巨噬细胞的炎症，调节巨噬细胞去极化，从而诱导VSMC松弛使血管保持舒张状态。研究发现，通窍活血汤能降低血清ET-1的表达，以保护血管内皮，从而减轻脑血管病患者的病情15。汤中麝香属于开窍药类，麝香辛温，气味芳香，走窜力强，还可引药上行，主要成分是麝香酮，有开闭、通窍作用。麝香酮能降低外周血中ET-1含量，并具有增加CGRP趋势，对脑神经有保护作用16。川芎能升高大鼠血清CGRP含量，减轻神经细胞炎症反应17；吴辉等18研究发现，川芎组大鼠CGRP含量明显高于模型组大鼠，提示川芎能提高大鼠血清CGRP含量，对血管的舒张起保护作用。红花黄色素（SY）是红花的重要药理组成，SY联合阿加曲班治疗能更好地改善AIS患者神经缺损情况，其机制可能与降低血清中ET-1水平有关19。SY注射液能提升颅脑损伤大鼠血清CGRP及SOD表达，能改善大鼠神经功能缺损情况20。电针联合SY治疗能降低患者血清ET-1水平，而提升CGRP水平，说明其治疗对血管起舒张效用，能在一定程度上改善脑供血不足21。通窍活血汤中各药物互相作用，能显著降低血液黏度，抑制血小板积聚，防止血栓产生，提升了纤溶酶的活性，增进血液的循环流动，维持了血管内皮的完整性，对VECs起保护作用。也进一步提高了纤溶酶的活性，使得血管内的细胞保持完整，促进血液有效循环。本研究发现，与模型组相比，通窍活血汤各剂量组ET-1表达均有所下降，CGRP表达提升，提示通窍活血汤能改善MCAO大鼠血管内皮张力，抑制血管的收缩因子释放，促进舒张因子的合成分泌，从而改善脑血流情况。本研究提示通窍活血汤能改善MCAO大鼠神经功能情况及血管内皮张力，可能是通过抑制血管的收缩因子释放，促进舒张因子的合成分泌，改善血流情况，从而发挥血管内皮的保护作用。参考文献 1 常红恩，郑娜，安红伟，等.通窍活血汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后血清中TNF-及IL-6水平的影响 J .成都中医药大学学报，2018，41(3 )：18-20，103.2 李永刚.通窍活血汤对急性缺血性脑卒中患者氧化应激反应及脑血流的影响 J .湖南中医杂志，2020，36(3 )：36-37.3 卢昌均，顿玲露，刘国成，等.通窍活血汤对脑缺血-再灌注大鼠基质细胞衍生因子-1的调控作用 J .医药导报，2016，35(1 )：44-46.4 韦冰心，卢昌均，刘国成，等.通窍活血汤对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马突触可塑性影响 J .辽宁中医药大学学报，2018，20(7 )：28-31.5 何芳雁，韩春妮，李艳，等.制作线栓法大鼠脑缺血再灌注模型的要点及体会 J .实验动物科学，2013，30(4 )：46-48.6 田莹，余化霖.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型制作要点及进展 J .齐齐哈尔医学院学报，2011，32(2 )：256-258.7 王玲，李江，徐少锋，等.人工麝香对大鼠急性脑缺血再灌损伤和脑出血的实验治疗 J .药学学报，2019，54(6 )：1036-1040.8 俞茹云，过忆，林莉莉.NF-B通路与川芎提取物抗脑缺血作用相关性研究 J .南京中医药大学学报，2017，33(1 )：74-77.9 李喆，刘娜，王雪，等.川芎水提取物与川芎嗪对氯化钴诱导的缺氧内皮细胞的作用比较 J .河南中医，2017，37(3 )：423-424.10 陈俊仁，谢晓芳，曹小玉，等.红花治疗缺血性脑卒中的机制研究进展 J .中国中药杂志，2022，47(17 )：4574-4582.11 郝二伟.桃仁油干预ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块内TF/TFPI表达及分子机制研究 D .南宁：广西中医药大63第 2 5 卷 第 2 期 2023 年 2 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.25 No.2 Feb.，2023雌激素受体介导的柚皮苷抗A25-35损伤PC12细胞凋亡作用研究王媛1，武凤1，熊辉1，徐艳明2，雷霞1，徐红丹2，孙慧峰1，张宁1，2，杨波1（1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 黑龙江 150040；2.黑龙江中医药大学佳木斯学院，佳木斯 黑龙江 154007）基金项目：国家自然科学基金面上项目（81673581）；国家科技重大专项（2018ZX09201009）；黑龙江省属高校科技成果研发、培育项目 （TSTAU-C2018020）；黑龙江省卫生健康委科研课题（2020-301，2020-303）；黑龙江中医药大学科研基金项目（2018jkcy05，2018pt04，2019BJP01）作者简介：王媛（1997-），女，山东泰安人，硕士在读，研究方向：中药药效物质基础及体内代谢研究。通讯作者：杨波（1972-），男，辽宁铁岭人，副研究员，硕士研究生导师，博士，研究方向：中药药效物质基础及质量评价研究。摘要：目的 探讨雌激素受体介导的柚皮苷（NG）抗淀粉样蛋白25-35（A25-35）诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的凋亡作用及其与雌激素受体（ER）信号通路的关系。方法 实验分为空白组、A25-35组、E2+A25-35组、NG+A25-35组、ICI182780+E2+A25-35组、ICI182780+NG+A25-35组。实验采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法（WB）检测细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达；RT-qPCR法检测细胞凋亡因子mRNA的表达。结果 Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术结果显示，与空白组相比，A25-35组细胞凋亡率升高（P0.01）；与A25-35组相比，NG+A25-35组细胞凋亡率降低（P0.01）；与NG+A25-35组相比，ICI182780+NG+A25-35组细胞凋亡率升高（P0.01）。WB结果显示，与空白组相比，A25-35组细胞Bax和Caspase-3蛋白表达量升高（P0.01），Bcl-2则相反（P0.01）；与A25-35组相比，E2+A25-35组Bax和Caspase-3蛋白表达量降低（P0.01），Bcl-2则相反（P0.01）；雌激素受体介导的NG的作用与E2相似，而ICI182780逆转了NG的作用。RT-qPCR结果显示，NG对细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响与蛋白结果一致。说明NG是通过激活ER信号通路发挥抗凋亡作用，作用与E2一致。结论 雌激素受体介导的NG有明显的抗凋亡作用，通过提高Bcl-2的正常表达，降低Bax和Caspase-3的正常表达发挥抗凋亡作用，其抗凋亡作用可能经ER介导。关键词：柚皮苷；淀粉样蛋白25-35；雌激素受体；抗凋亡作用中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2023)02-0063-05Effects of Estrogen Receptor-mediated Naringin on Apoptosis of A25-35 Injured PC12 CellsWANG Yuan1，WU Feng1，XIONG Hui1，XU Yanming2，LEI Xia1，XU Hongdan2，SUN Huifeng1，ZHANG Ning1，2，YANG Bo1（1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Jiamusi College，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）Abstract：Objective To investigate the effect of estrogen receptor-mediated naringin（NG）on the apoptosis of rat adrenal pheochromocytoma（PC12）cells induced by-amyloid protein25-35（A25-35）and its relationship with estrogen receptor（ER）signaling pathway.Methods The experiment was divided into blank group，A25-35 group，E2+A25-35 group，NG+A25-35 group，ICI182780+E2+A25-35 group，ICI182780+NG+A25-35 group.Annexin V-FITC/PI double staining was used to detect the apoptosis rate of cells.The expression of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 were detected by western blotting（WB）.The mRNA expression of apoptosis factor was detected by RT-PCR.Results Annexin V-FITC/PI double staining flow 学，2016.12 赵辉，邢若丹，谢婷婷，等.葱白提取物对心肌梗死模型大鼠心肌纤维化及TGF-_1与Smad2蛋白表达的影响 J .医药导报，2020，39(5 )：604-609.13 邢明媚，韦知樱，许俊.降钙素基因相关肽与动脉粥样硬化 J .现代生物医学进展，2011，11(12 )：2398-2400.14 DUAN J X，ZHOU Y，ZHOU A Y，et al.Calcitonin gene-related peptide exerts anti-inflammatory property through regulating murine macrophages polarization in vitro J .Molecular immunology，2017，91：105-113.15 赵桂荣，于存娟，张义松，等.通窍活血汤联合康复训练治疗老年脑卒中后血管性痴呆（瘀血内阻证）疗效及对患者血管内皮活性物质的影响 J .四川中医，2021，39(3 )：145-148.16 黄丽，朱彩霞，张芹欣，等.四种开窍药对急性不完全性脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑保护作用 J .中国比较医学杂志，2018，28(8 )：77-82.17 李丹丹，姚红艳，孙凯.超微川芎茶调散对偏头痛模型大鼠-EP、CGRP的影响 J .现代医学与健康研究电子杂志，2020，4(3 )：1-3.18 吴辉，王帆，魏丹，等.白芷、吴茱萸、川芎对偏头痛大鼠血清NO，5-HT含量及脑干组织CGRP表达的影响 J .湖北中医药大学学报，2018，20(6 )：17-20.19 王宇，赵珊珊，郑玉敏，等.红花黄色素联合阿加曲班治疗急性脑梗死的疗效及对血清IL-8、ET-1、NO水平和血液流变学的影响 J .中西医结合心脑血管病杂志，2018，16(1 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