DB6528T189-2023加工辣椒品种InDel指纹数据库构建规范.pdf

ICS67.080.01CCS B 316528巴 音 郭 楞 蒙 古 自 治 州 地 方 标 准DB 6528/T 1892023加工辣椒品种 InDel 指纹数据库构建规范Processing pepper varieties InDel fingerprint database constructionspecification.2023-08-01 发布2023-08-15 实施巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局发 布DB 6528/T 1892023I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14InDel 标记鉴定程序.25标记类型及标记来源.26检测方法.27质量保证.2DNA 质量.2引物序列.2酶及 PCR 反应相关试剂.3PCR 扩增反应.38样品的来源及性质.3品种来源.3样品类型.3样品分析数量.39引物及流程的评估.3评估用的品种数量及名单的确定.3引物评估的取舍.410不同来源数据的有效整合.4固定一套核心引物.4提供标准品的要求.4提供标准 DNA 的要求.4确定引物等位基因 BIN 的要求.4异常带型的数据处理方式.4数据的编码方式.411构建品种 DNA 指纹模式库.512构建品种 DNA 指纹扩展库.513数据库数据的随机盲测.5DB 6528/T 1892023II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局提出并归口。本文件起草单位：新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院、新疆维吾尔自治区农业科学研究院园艺所。本文件主要起草人：张建文、张国儒、杨生保、唐亚萍、杨涛、李辉玲、帕提古丽艾斯穆托拉、火顺利、董洁、叶远荣。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院。对本文件的修改意见或建议，请反馈至新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局（新疆库尔勒市石化大道64号小区）、新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院（新疆库尔勒市英下路巴州农科院）、新疆维吾尔自治区农业科学研究院园艺所（新疆乌鲁木齐市沙依巴克区新疆南昌路403号）、新疆巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局（新疆库尔勒市延安路27-1号）。新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院 联系电话：[phone]；邮编：841000新疆维吾尔自治区农业科学研究院园艺所 联系电话：[phone]；邮编：830091新疆巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局 联系电话：[phone]；邮编：841000DB 6528/T 18920231加工辣椒品种 InDel 指纹数据库构建规范1范围本文件规定了加工辣椒品种InDel标记方法及标记来源、检测方法、质量保证、样品的来源及性质、引物及流程的评估、不同来源数据的有效整合、构建品种DNA指纹模式库、构建品种DNA指纹扩展库、数据库数据的随机盲测的要求。本文件适用于加工辣椒品种鉴定及DNA指纹库的建立。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。InDel 标记Insertion-deletion根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物，这就InDel标记。DNA 指纹DNA fingerprint具有完全个体特异的DNA多态性，同个体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGEPolyacrylamide gel electrophoresis是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。注：根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开，适合变性蛋白的处理。引物primer是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3-0H上，核苷酸以一酯链形式进行合成，因此引物的3-0H，必须是游离的。核心引物core primers指多态性、稳定性、重复性等综合特性好、可作为DNA指纹鉴定优先选用的一套引物。注：包括基本核心引物和扩展辅助核心引物。其中基本核心引物作为固定用于品种鉴定和建库的引物，保证不同实验室数据具有可比性并可进行数据整合。扩展辅助核心引物相对固定，并可根据引物的最新研究结果和特殊鉴定性状进行调整。标准品种standard varietyDB 6528/T 18920232DNA指纹库构建过程中作为谱带分型的参照标准，并辅助判断试验的稳定性和可靠性。注：以一套典型的遗传基础广泛的高度纯合自交系为试材，对拟建库的引物进行DNA指纹分析，就可确定代表每个引物不同谱带的标准品种名单。标准 DNAstandard DNA由一个实验室统一按规定的DNA提取方法一次性提取足量的标准品种的DNA，经DNA指纹分析验证其真实的指纹带型后统一发放。4InDel 标记鉴定程序通过设计特异性引物并进行PCR扩增反应，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳（或聚丙烯酰胺凝胶电泳）和放射自显影（或银染），可检测到在简单重复序列重复单位数不同的DNA区域的多态性。5标记类型及标记来源采用InDel标记作为加工辣椒DNA指纹库构建的标记方法。6检测方法变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结合银染检测最小分辨率可达到1 bp。7质量保证DNA 质量纯度要求:OD 260/OD 280在1.82.0之间。引物序列应明确引物是否采用荧光标记，如采用荧光标记，应明确采用何种荧光标记以及是否采用加尾序列。根据加工辣椒建库的具体情况，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳荧光检测系统的数据作为建库的标准数据，并规定不同引物应标记的荧光类型，所有建库标准指纹数据均是采用无加尾序列的引物获得的。目前已筛选的引物序列见表1：表 117 对引物序列表引物编号标记名称上游引物下游引物InDel16CIDH119AGGAACTAAAAAGTGGTTTTGGGTTCACACACGTCCAACCCAATInDel33CIDH108ACAATCGAAGGGGAGCCTTGTCCTCTGTTTCATGATTCCGACTInDel41CIDH116AGGAGAAAAAGAAAGAACAACCACACGAAGCCCTTCACATTAACGTInDel63CIDH110ACTCTTGGAAGATGGGGTTCACCGAAGTAAAATAGGAAAATTGCCAInDel88CIDH107AGCCCAATAGAAAGATTGCTCACGCTGAATTTTGAAATATTTAGTCTGGInDel137CIDH128ACAAGGAGAAAAGGGGCCTTCTGTATCTCGGCTTAAAGGGGTInDel146CIDH109GGAACCCGACCACCAGAAAATCGCGGGGACTATTTACCCTInde1172CIDH135GGTGGGACCAAAGAGAGTTTTGAACAAGCAAAAGCCAAGADB 6528/T 18920233表117对引物序列表（续）引物编号标记名称上游引物下游引物InDel200CIDH135ACTCACAGTCCTTAAACTTACAAAACTTGCCACTATAAATCCATCACCGAInDel201CIDH136AGGCACCAGTTAGCTCGAAAAGCGCATCTCAATCTATGTCGAInDel206CIDH113CCTGGAGGCTATGCACCATTATTTGCAGCCACCCAGCATAInDel209CIDH116CGCTACGAGTGGTACCTGACTGGGGATTGCTTCATTGGTGTInDel211CIDH118TCAGTTGTGTCCTGAACCCTACATGCAGAACAAATAGCCCTInDel215CIDH122ACCGTTGACACTTCCATGCTAATCCCCACGTGCAGTTCATInDel219CIDH126CCGAGCATTGAGACCGAGTTAAGCTTTCTGATCCACCCCCInDel228CIDH135TGACACGTGACATTCAGCGTTGACCTACAAACACACTGCTCAInDel234CIDH113AAAAAGGGCAGCTCGGTGTAGAACCCCCTGAAGAGAAGGC酶及 PCR 反应相关试剂对构建标准DNA指纹库时采用的试剂指定供货厂家及规格。PCR 扩增反应统一采用相同的反应程序及反应体系。8样品的来源及性质品种来源品种来源应可靠，建库品种主要来自：新疆维吾尔自治区区域试验和品种审定委员会审定的品种以及品种权保护部门保护的品种；国家种质资源库；向育种单位直接征集。样品类型主要包括种子或叶片。可以提供叶片等营养组织或提供符合要求的DNA样品。样品分析数量根据繁殖方式不同而有区别。由于加工辣椒材料具有多种繁殖方式，对完全纯合的自交系材料和高度一致的单交种材料规定每个品种分析3个5个个体；对农家种、综合种、开放授粉品种、除单交种外的其它类型杂交种（三交、双交等），如果采用混合样品，每个品种至少混样3份，每份混样至少混合10个个体。9引物及流程的评估评估用的品种数量及名单的确定DB 6528/T 18920234在控制合适的数量的情况下，材料应具有代表性和比较广泛的遗传基础。应至少包括12套遗传上或形态上极为相似的材料以评估引物对近似品种的区分能力。引物评估的取舍10不同来源数据的有效整合不同来源DNA指纹数据的有效整合问题是DNA指纹库构建过程中的重点，为了解决这一难题，通过对大量的研究进行总结归纳，提出以下几种解决策略，这些策略可以结合起来进行。固定一套核心引物17对引物作为构建加工辣椒DNA指纹数据库用的基本核心引物。提供标准品的要求标准品的要求如下：除了少数稀有谱带类型不易找到标准品种时选用特殊自交系外，宜尽量选用国内外已知的常用自交系为标准品种；标准品种应纯合；标准品种应容易扩繁保种；标准品种由指定的单位统一扩繁保种，统一发放；宜尽量用较少的品种代表较多种谱带类型。提供标准 DNA 的要求提供标准DNA的要求如下：DNA 质量符合要求，纯度高，OD 260/OD 280 在 1.82.0 之间；DNA 经过指纹分析反复验证，证明能够稳定扩增出预期大小的谱带；同一批次提取的 DNA 量要大，大于或等 50 ug。确定引物等位基因 BIN 的要求确定引物等位基因BIN的要求如下：应包括主要的等位基因；如果稀有等位基因也包括在内的话，应标注其为突变型；每个等位基因根据其表现特征，确定其扩增片段大小的区间范围。异常带型的数据处理方式异常带型主要包括：稀有带型、零带型、弱带型、缺失带型等。对稀有带型应如实记录，但应标注其为稀有带型；对零带型应尽量避免，如果某引物出现的零带型比率较高（5%），则该引物应剔除；对弱带型及缺失带型应尽可能通过重新扩增将数据补齐。数据的编码方式主要有3种：DB 6528/T 18920235根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，确定不同的谱带类型，并按扩增片段从大到小的顺序编号。适用于仪器不具有直接读取片段大小的功能的情况；根据扩增产物的片段大小，直接记录不同谱带片段大小。适用于仪器具有直接读取片段大小的功能且同一多态性位点上采用的引物固定的情况；将同一多态性位点设计的不同引物获取的数据进行整合。适用于在同一多态性位点同时设计并使用了多个不同引物进行数据库构建的情况。数据整合采取如下两种方案：1)采用记录扩增片段绝对大小的方式。指定某个引物为该多态性位点的标准引物，该位点设计的其它引物获得的数据按照片段大小整体向上或向下位移的规律，统一转换成标准引物的数据。2)采用记录片段相对大小的方式。规定引物扩增的最小片段的谱带长度为 0，同一位点的所有引物的数据均以实际片段大小减去该引物扩增的最小片段大小后记录，因此，同一引物位点无论采用多少不同的引物，所获得指纹的编码方式是不变的，但应提供该引物位点不同引物的最小片段大小。11构建品种 DNA 指纹模式库确定构建模式库的材料名单及来源。根据自治区加工辣椒的情况，模式库品种包括常用自交系，已审定的主推杂交种，自治区参加区试的新品种，自治区具有品种权保护品种。利用不同实验室或不同检测设备同时检测。不同实验室采用相同的标准试验体系，共用一套建库核心引物，指定实验室提供代表每个核心引物主要谱带的标准品种或标准DNA，用标准品种建立标准谱带或Bin，再进行DNA指纹数据分析。如果结果不同，可更换样品或DNA后复检。最终建立数据高度准确的模式库。12构建品种 DNA 指纹扩展库扩展库品种主要为今后每年新参加区试的品种、新申请品种权保护的品种以及新的自交系材料，此外还包括实际检测案例中的匿名品种。13数据库数据的随机盲测由于扩展库数据没有经过多个实验室同时验证，为了检验入库数据的质量，从扩展库中随机抽取若干样品（一般取5%10%）编号后分给不同实验室，釆用统一规定的标准样序进行盲测，以验证数据库中数据的准确度及评价入库数据的质量。