基因工程的工具酶.doc

基因工程的工具酶(完整资料）
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基因工程的工具酶

n 限制性核酸内切酶
n DNA连接酶
n ＤNＡ聚合酶
n 碱性磷酸酶
n 末端脱氧核苷酸转移酶

限制性核酸内切酶
是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DＮA水解酶。
是体外剪切基因片段的重要工具
限制性核酸内切酶不仅是DNＡ重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定

防御机制：
n 任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制
n 人:免疫系统
n 细菌：限制与修饰系统

寄主控制的限制与修饰现象
限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段,　各种细菌都能合成一种或几种能够切割DＮA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内,但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNＡ进行了修饰,限制性酶对修饰过的DNＡ不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制酶 (rｅstrｉction enzymｅ）
修饰酶 （mｏdｉｆying enｚｙme)

核酸酶切位点：
既可以在３ˊ，5ˊ－磷酸二酯键的3ˊ酯键处（A),
也可以在5ˊ酯键处（B）切断磷酸二酯键

1） 核酸限制性内切酶的类型
2） 核酸限制性内切酶的基本特性
3） 同裂酶和同尾酶
4） 核酸限制性内切酶的命名法
5） 影响核酸限制性内切酶活性的因素

限制性核酸内切酶的类型及特性
按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同，分为三类:
Ⅰ型
Ⅱ型*
Ⅲ型

第一类（Ｉ型）限制性内切酶：
　 能识别专一的核苷酸顺序
并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链
但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的
这类限制性内切酶在ＤＮA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DＮA结构或克隆基因
如：EcoB、ＥcoK等

第二类(II型)限制性内切酶：
　能识别专一的核苷酸顺序(回文对称顺序)
并在该顺序内的固定位置上切割双链
　 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一

这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别５个核苷酸以及7个、8个、９个、10个和11个核苷酸的

回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同

n 切割后形成具有粘性末端(cohｅsiｖｅ end)的ＤNA片段
n 切割后形成具有平末端（blｕnt end)的DNA片段
限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链

第三类(　IIＩ型)限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端,因此不能应用于基因克隆

同裂酶和同尾酶
n 同裂酶（同切酶或异源同工酶):
两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时,一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。
例如：
HpaⅡ和ＭspⅠ的识别顺序都是CＣＧG
如果其中有5’－甲基胞嘧啶，则只有HｐaⅡ能够切割
n 同尾酶:
有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶
　　可以通过ＤNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点
如:Xba1、Nhe1以及Ｓpe1切割的DＮA序列不同,但均给出相同的“ＣＴAＧ”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即　Bfａ1的酶切位点

限制性核酸内切酶的命名法
n 取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面.如果同一菌株先后发现几个不同的酶,则用罗马数字加以表示
n ＥｃoＲ I
　 　E: 表示大肠杆菌属名第一个字母
cｏ:　表示种名头两个字母
　R： 表示菌株名
　 I： 表示该菌中第一个被分离出来的酶

影响核酸限制性内切酶活性的因素
n 反应的温度
n DNＡ的纯度
n 溶液中离子浓度及种类
n 缓冲液的pH值
n 酶切时间
n DNA的分子结构

限制性内切酶在保温过程中的活性变化(图解)

反应体系
n 1０ Ｘ Ｂｕffer
n DＮＡ
n 酶
n H2O

注意酶的浓度:并不是加得越多越好！
根据ＤNA的量选取合适的酶量
1个酶单位:以20μＬ反应体系中反应1小时，使1 μg ＤＮA完全消化所需要的酶量

ＤNA末端长度对限制酶切割的影响
n 限制酶切割DNＡ时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说，在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则很难发挥切割活性
n 限制性内切酶的Staｒ　ａｃtiviｔy
是指当酶的反应条件改变时，其在识别序列以外的位点进行切割

修饰酶－－甲基化酶
又称甲基转移酶（mｅthｙｌtrａnsferase）
在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶
实验室里大部分大肠杆菌菌株含有3个位点特异的甲基化酶：
n Dａｍ甲基化酶，由dam基因编码,将S—腺苷甲硫氨酸的甲基基团转移到ＧATC中A的N6位置上
n Dcｍ甲基化酶，由ｄｃm基因编码,以前称Meｃ甲基化酶,在Ｃ５位置修饰CCＡGG和ＣCTＧＧ的胞嘧啶（C）残基, 位点256－5１２bp出现一次
n EcoK I甲基化酶,识别AAC(Ｎ）6GTGC和GCAC（N)６ＧTＴ序列中的A的N6位置，位点少，约8 ｋb出现一次
n Ｓss Ｉ甲基化酶

从某种Daｍ ＋ 或Dcm ＋的菌株中分离的DNＡ可能抗从自身分离的限制性内切酶的切割
　　 　例如： Mbo I 和Sau 3A　Ｉ识别序列ＧATC
　 　从Dam+大肠杆菌中分离到的DNA完全不受Ｍbo　Ｉ 的切割， 但是不抗Sau　3A　I

来自原核生物螺原体（Ｓpirｏｐlaｓma　sp.），可使CG序列中的Ｃ在C５位置上甲基化
Ssｓ I甲基化的ＤNA受Ｅ。coli中ｍcrA， mcrBC和mrr系统的限制
许多酶对此甲基化酶敏感,如：Aａｔ II， Clａ I， Xho I， Sａl　Ｉ

如果将外源DＮA引入一个大肠杆菌的宿主，它可能会受宿主细胞中的限制系统的袭击
因此, 消除大肠杆菌重组分子宿主菌株中的限制系统具有重要意义
(大肠杆菌的所有限制系统都集中在一个长约14 kb的迁移控制区内)

某些菌株在这些基因中的某个上携带突变
如: ＤH5菌株在ｈsdＳ基因内有突变,　因此是EcoＫ I内切酶缺陷型的
普遍应用的菌株ＨB１０1是整个迁移控制区都缺失，因此缺乏所有的限制活性

DNA连接酶：在体外将目的基因和载体共价连接构成重组DNA分子
Ｔ4 DNA连接酶
大肠杆菌ＤNA连接酶

反应体系
n 5 Ｘ Ｂuffer (10 X Buffer )
n Veｃｔor
n DＮA Fragmeｎｔ
n T4 ＤNA 　Ｌigase
n Ｈ２O

连接反应的温度
n 平末端
　　 　1６℃ 4-１6　hoｕr

n 粘性末端
　 　1６℃ 3 hoｕr ｏｒ
4　℃ １6　ｈour

DＮA聚合酶
不同种类的DＮA聚合酶在DNA的复制和修复中起到重要的作用
n 大肠杆菌DＮA聚合酶I
n Klenoｗ　大片段
n 耐热 DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的酶活性:
1) ５'→3'　DＮA聚合酶活性
　2) 5’→3’　DNA外切酶活性（ 5’端降解）
　 　3) 3’ →５’ DNA外切酶活性(纠错）

Kleｎow 大片段：
大肠杆菌ＤＮA聚合酶I 经蛋白酶处理后产生的大片段活性：
　 　　１）5’→3’ DNＡ聚合酶活性
　 2)3' →５’　DNＡ外切酶活性（纠错)

耐热 DNA聚合酶
来自于嗜高温的细菌，主要用于PCR反应
如:Taq ＤNA聚合酶
　 　 Vｅnt DNA聚合酶
　 　 Pｆｕ　DNA聚合酶
　 　　 　　 Ｐwo　DNA聚合酶
　 　　 　　 　Ｔth DNA聚合酶

碱性磷酸酶
n 去除5’磷酸基团
n 底物： DNＡ、RＮＡ、脱氧核糖核苷三磷酸
n 应用： ａ。 ５'端标记之前的处理
ｂ. 处理克隆载体防止载体自连
c.　外源ＤNA片段的末端处理防止片段间的连接

目前常用的有两种：
细菌碱性磷酸酶（BAP），耐高温，不易失活,要终止和灭活它很困难
小牛肠道碱性磷酸酶（CIP）,可在６５℃加热45miｎ灭活，活性高，因此更为常用

末端脱氧核苷酸转移酶（TｄT)
n 从小牛胸腺中分离纯化出来的
特点：（1）不需要ＤNＡ模板
　 (2） 沿着5’→３’方向将脱氧核苷酸加到DNA链的３’羟基末端
n 应用:(１）催化DNA的3＇末端添加同聚物
　　　　(2）DＮＡ的3’末端标记

琼脂糖酶（ａｇarase)
n 是一种琼脂糖水解酶
n 可以将琼脂糖亚单位水解为新琼脂寡糖
n 用于从低熔点琼脂糖中分离纯化大片段DNA或RNA片段
n 对热稳定，反应时不需要缓冲液
1．3 基因工程的应用
基因工程自２0世纪７0年代兴起后，在短短的30年间，得到了飞速的发展，目前已成为生物科学的核心技术.基因工程在实际应用领域—农牧业、工业、环境、能源和医药卫生等方面，也展示出美好的前景.
植物基因工程硕果累累
植物基因工程在农业中的应用发展迅速.从1996~２0０１年，在短短的5年中，全世界转基因作物的种植面积　就增长了3０倍。以转基因植物研究、开发和应用为标志的农业技术革命,已经在一些国家展开。２０0１年,就世界范围来看,转基因植物种植面积首次突破5x106hm２。其中，转基因大豆、棉花、油菜、玉米已进入大规模商业化应用阶段，这四种转基因作物种植面积占相关作物种植面积的比例已达到：大豆63％,玉米1９％,棉花1３%，油菜５%。我国转基因作物的种植面积也迅速增长，目前已位居世界第四（图1－ 16).　　　

　 植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力（如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等),以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
抗虫转基因植物
全世界每年因虫害造成农作物的损失约占总产量的1３%,达数千亿美元。对农业害虫的防治,大多是依靠化学农药.大量使用化学农药不仅造成了严重的环境污染,损害了人类健康，而且大大增加了生产成本.因此，从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因,将其导入作物中,使其具有抗虫性，已成为防治作物虫害的发展趋势.目前，已问世的转基因抗虫植物主要有水稻（图1—1７）、棉、玉米、马铃薯、番茄、大豆、蚕豆、烟草、苹果、核桃、杨、菊花和白花三叶草等。用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等.例如,我国转基因抗虫棉就是转入Ｂt毒蛋白基因培育出来的,它对棉铃虫具有较强的抗性。

近几年来，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉的研究和应用,取得了突飞猛进的发展,从1998年占据市场份额的10%,已经提高到200０年的6４。4%，居主导地位。仅２002年我国抗虫棉的栽培面积已达9５x １0４ｈm2,增加收益约2０亿元人民币。

生物技术资料卡
可用于转基因植物的抗虫基因
Bt毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌中分离出来的抗虫基因。当害虫食用含有转基因的植物时，　Ｂt基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,在消化酶的作用下.蛋白质能够降解成相对分子质量比较小的、有毒的多肽。多肽结合在肠上皮细胞的特异性受体上,会导致细胞膜穿孔,细胞肿胀裂解,最后造成害虫死亡。由于Bt毒蛋白对哺乳动物无毒害作用,因而广泛用于抗虫转基因植物.
蛋白酶抑制剂基因广泛存在于植物中，它产生的抑制剂可与害虫消化道中的蛋白酶结合形成复合物,从而阻断或降低蛋白酶的活性，使昆虫不能正常消化食物中的蛋白质.这种复合物还能剌激昆虫分泌过量的消化酶，引起害虫的厌食反应。
淀粉酶抑制剂基因产生的淀粉酶抑制剂可以抑制昆虫消化道中的淀粉酶活性,使害虫不能消化所摄取的淀粉,从而阻断害虫的能量来源。
植物凝集素基因控制植物合成一种糖蛋白，这种糖蛋白可与昆虫肠道黏膜上的某种物质结合,从而影响害虫对营养物质的吸收和利用。
抗病转基因植物
植物像人一样也会生病。引起植物生病的微生物称为病原微生物,主要有病毒、真菌和细菌等。例如,许多栽培作物由于自身缺少抗病毒的基因，因此，用常规育种的方法很难培育出抗病毒的新品种，而基因工程技术，为培育抗病毒植物品种开辟了新的途径。目前,人们已获得抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦（图1-１８）、甜椒（图1—19）、番茄等多种作物。

抗病转基因植物所采用的基因，使用最多的是病毒外壳蛋白（coat ｐroｔein，　CP）基因和病毒的复制酶基因；抗真菌转基因植物中可使用的基因有几丁质酶基因和抗毒素合成基因。
抗逆转基因植物
环境条件对农作物的生产会造成很大影响。例如,盐碱、干旱、低温、涝害等不利的环境条件，是造成低产、减产的常见因素。目前，全球的盐碱和干旱地区分别占陆地面积的1/3，还有许多地区属于高寒地区。这些不利的环境条件也会对农业生产造成影响。由于盐碱和干旱对农作物的危害与细胞内渗透压调节有关,目前科学家们正在利用一些可以调节细胞渗透压的基因，来提高农作物的抗盐碱和抗干旱的能力,这在烟草等植物中已获得了比较明显的成果。科学家们还研究开发出了一批耐寒作物，使它们在寒冷的环境条件下,良好地生长。例如，将鱼的抗冻蛋白基因导入烟草和番茄（图1 -20)，使烟草和番茄的耐寒能力均有提高。此外,将抗除草剂基因导入大豆、玉米等作物（图１ —　２1）,喷洒除草剂时，杀死田间杂草而不损伤作物.

利用转基因改良植物的品质
随着人们生活水平的提高,人们对食品的要求不仅仅是吃饱,而且要富于营养。但是，我们吃的许多食品含有的营养成分并不平衡，例如，豆类食品中，含有蛋氨酸比较少，大米、玉米、小麦则含赖氨酸比较少。这些人体必需的氨基酸缺少后对人的健康不利。科学家将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因,导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。例如,我国科学家将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸的含量比对照提高30% （图1－22）。

番茄含有丰富的维生素，但不耐储存.我国科学家将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，获得转基因延熟番茄，储存时间可延长１~２个月，有的可达80多天。目前，我国农业部已批准这种耐储存番茄进行商品化生产。我国科学家还成功地将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变异, 大大提高了花卉的观赏价值(图１-23)。

异想天开
发光树能做路灯吗？
自然界有许多生物可以发光，它们发出的光有磷光和荧光两种.大家最熟悉的是萤火虫,在夏天的夜晚，它们那“腾空类星陨,拂树若花生”的美丽荧光,曾引起人们的许多遐想.科学家研究发现,萤火虫发光是发光器中的荧光素，在荧光酶的催化下发出的间歇光。
荧光素和荧光酶都是由发光基因“指挥"合成的。如果将发光基因导入植物,培育出发光植物是一件十分有趣的事情。目前，科学家已培育出发光的烟草、棉花等.科学家们正计划培育一种发光的夹竹桃，将其种植到高速公路的两旁，白天做行道树,夜晚做路灯照明。到那时，每当夜幕降临，公路两旁的夹竹桃荧光闪闪，树树相连,公路将变成美丽的荧光世界。也许不久的将来，你可以用各种各样的发光植物来装点你的庭院和家居，那是多么漂亮、有趣!

动物基因工程前景广阔
　　 动物基因工程是20世纪8０年代开始发展起来的,它从诞生那天起,就在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等很多方面显示了广阔的应用前景。
　　　 用于提高动物生长速度
动物基因工程技术可以提高动物的生长速率.由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快,因此,科学家们将这类基因导入动物体内,以提高动物的生长速率。例如,将外源生长激素基因导入绵羊体内，转基因绵羊的生长速率比一般的绵羊提高3０%,体型增大50％；将外源生长激素基因导入鲤鱼，9个月后有的转基因鲤鱼比对照重1。５kg　（图1－24)。

用于改善畜产品的品质
动物基因工程技术的另一个重要作用是改善畜产品的品质.例如，有些人食用牛奶后,对牛奶中的乳糖不能完全消化；也有些人食用牛奶后会出现过敏、腹泻、恶心等不适症状。为了解决这一问题,科学家将肠乳糖酶基因导人奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大减低,而其他营养成分不受影响。
用转基因动物生产药物
最令人兴奋的是利用基因工程技术，还可以使哺乳动物本身变成“批量生产药物的工厂"。科学家将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，然后，将受精卵送入母体内，使其生长发育成转基因动物。转基因动物进人泌乳期后,可以通过分泌的乳汁来生产所需要的药品,而称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已在牛和山羊等动物乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和ｃｘ抗胰蛋白酶（图1一25)等重要医药产品。

用转基因动物作器官移植的供体
动物基因工程技术有可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。目前,人体移植器官短缺是一个世界性难题.为此，人们不得不把目光移向寻求可替代的移植器官.由于猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似，而且猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要远远少于灵长类动物，是否可以用猪的器官来解决人类器官的来源问题呢？科学家将目光集中在小型猪身上。实现这一目标的最大难题是免疫排斥。目前，科学家正试图利用基因工程方法对猪的器官进行改造,采用的方法是将器官供体基因组导入某种调节因子,以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术,培育出没有免疫排斥反应的转基因克猪器官。
基因工程药物异军突起
基因工程制药是制药行业突起的一支新军，不仅具有独特的优势，发展速度也很快。
自20世纪20年代初，第一种基因工程药物―重组人胰岛素投放市场以来，利用转基因的工程菌①生产的药物已有60多种。这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗、激素等。这些药物可以用来预防和治疗人类肿瘤、心蓝病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病.目前，美国、日本、德国等是世界上主要开发生产基因工程药物的国家.2０世纪９0年代以来，我国自己生产的白细胞素－2、干扰素、乙肝疫苗等近２0种基因工程药物投放市场场，年产值达３0亿元人民币（图1－20）。

假如某位心脏病人换上了经过改造的猪的心脏，在生活中他会遭到歧视吗？
① 基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”

图１－２６　我国生产的部分基因工程药物

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用ＤNＡ重组技术生产的人类蛋白药物种类(部分）
蛋白名称
用途
α一抗胰蛋白酶
治疗肺气肿
促肾上腺皮质激素
治疗风湿
B细胞生长因子
治疗免疫系统功能失调
降钙素
治疗软骨病
红细胞生成素
治疗贫血
生长激素
促进生长
生长激素释放因子
促进生长
胰岛素
治疗糖尿病
干扰素
抗病毒，抗肿瘤
白细胞介素
治疗癌症
血清白蛋白
血浆补充物
肿瘤坏死因子
抗肿瘤
我国生产的基因工程药物还有哪些?请查阅资料或上网查询。
干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵染后产生的一种糖白。由于干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染,如水痘、肝炎、狂犬病等病毒引起的感染，甲此，它是一种抗病毒的特药。此外，干扰素对治疗乳腺癌、骨髓癌、淋巴癌等癌症和些白血病也有一定疗效。传统的干扰素生产方法是从人血液的白细胞内提取的，每3０0L血液只能提取出1mg干扰素。１９80~19８2年,科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，从１ｋｇ细菌培养物中可以得到20～40ｍg干扰素.主要用于治疗乙型肝炎的重组人干扰素a－1b是我国第一个国内批准生产的基因工程药物（19９３年）。我国基因工程药物开发虽然起步较晚，基础较差，但是,仅仅用了约10年的时间，就使基因工程药物从无到有,不断发展壮大，完成了世界上主要基因工程药物的产业化。
干扰素的生产车间

以侯云德院士（右）为首的研究人员，成功地研制出了我国第一个基因工程药物――干扰素。 　 　 　 　　

基因治疗曙光初照
　　人体的遗传性疾病是很难用一般药物进行治疗的，基因工程的兴起迎来了基因治疗的曙光。
基因治疗是把正常基因导人病人体内,使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的,这是治疗遗传病的最有效的手段。19９O年9月,美国对一名患有严重复合型免疫缺陷症的4岁女童,实施了基因治疗.复合型免疫缺陷症是一种遗传疾病。女童由于腺苷酸脱氨酶基因缺失，造成体内缺乏腺苷酸脱氨酶；而腺苷酸脱氨酶是人体免疫系统发挥正常功能作用所必需的，因此,女童不能抵抗病原微生物的威胁.１9９０年9月，这名女童接受了基因治疗，研究人员将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，使淋巴细胞能够产生腺苷酸脱氨酶,然后，再将这种淋巴细胞转人患者体内.半年后，在血液中检测出了被改造的淋巴细胞，女童体内产生的腺苷酸脱氨酶也越来越多，女童产生抗体的能力显著改善。
针对这一实例，你能提出什么问题吗？
从1９90年成功转移腺苷酸脱氨酶基因到现在,大部分基因治疗的临床试验，都是先从病人体内获得某种细胞，例如T淋巴细胞，进行培养,然后,在体外完成基因转移,再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输人患者体内（图1－27，1-28）。上述方法虽然操作复杂,但效果较为可靠,称为体外基因治疗。同时,科学蒙们又千方百计设计出更加简便的基因治疗方法。例如,１99４年美国科学家利用经过修饰的腺病毒作载体,成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因转人患者肺组织中。这种直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法叫做体内基因治疗.值得提出的是，无论哪一种基因治疗，目前都处于初期的临床试验阶段.可以说,在没有完全解释人类基因组的运转机制,充分了解基因调控机制和疾病的分子机理之前,进行基因治疗是十分困难的。另外，还存在着技术方面、伦理道德方面，以及安全性方面的诸多困难.如果这些问题能逐一解决的话,基因治疗将推动2I世纪的医学革命。

图1－2７　我国研究人员正在制备用于治疗的基因工程细胞
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用于基因治疗的基因种类
用于基因治疗的基因有三类。第一类是从健康人体上分离得到的功能正常的基因,用以取代病变基因，或依靠其表达产物，来弥补病变基因带来的生理缺陷，如对血友病和地中海贫血病的治疗。第二类是反义基因，即通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNＡ进行互补,来阻止非正常蛋白质合成。第三类是编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因,又叫做自杀基因。
拓展视野
神奇的基因芯片
你听说过“基因芯片"（gene chiｐ）一词吗？基因芯片又叫做DNA芯片,寡核苷酸芯片,或ＤNA微阵列。其概念来自计算机芯片,是伴随“人类基因组计划"的研究进展而快速发展起来的一门高新技术。那么,基因芯片究竞是什么？它的作用又是怎样的呢?通俗地说,基因芯片是通过微加土技术,将数以万计、乃至百万计的特定序列的ＤNＡ片段（基因探针），有规律地排列固定于2ｃｍ２的硅片、玻片等支持物上， 构成的一个二维DNA探针阵列,与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片.基因芯片主要用于基因检测工作。科学家让芯片上成千上万的探针分子，与被检测的带有标记的基因样品，按碱基配对原理进行杂交。 然后,通过荧光检测系统对芯片进行扫描，再利用计算机系统，对每一探针上的荧光信号进行比较和检测，从而迅速得出所需要的信息。
基因芯片的用途广泛,可以用于基因测序,寻找有用的目的基因，或对基因的序列进行分析。例如,科学家用基因芯片分析了黑猩猩与人某段基因序列的差异，结果发现二者核酸序列同源性在８3.5％~98．2％之间,揭示了二者在进化上的高度相似性。
科学家是根据从正常人的基因组中分离出的DNA与DNＡ芯片杂交，可以得出标准图谱，以及从病人的基因组中分离出DNA与DNＡ芯片杂交，可以得出病变图谱,再通过比较上述两种图谱，来对人类的许多疾病（如感染性疾病、遗传性疾病、恶性肿瘤等)进行诊断的.基因芯片在临床诊断方面表现出的独特优势是:它不仅能在早期诊断中发挥作用；与传统检测方法相比，它可以在一张芯片上，同时对多个病人进行多种疾病的检测；利用基因芯片，还可以从分子水平上了解疾病.基因芯片的这些特点，能够使医务人员在短时间内掌握大量的疾病诊断信息，找到正确的治疗措施。除此之外,基因芯片在新药的筛选、临床用药的指导等方面,也有重要作用。
　 　总之，基因芯片诊断技术以其快速、高效、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术,并成为学术界和企业界所瞩目的研究和开发的热点。

思考与探究
1．根据所学内容，试概括写出基因工程解决了哪些生活，生产中难以解决的问题。
２.右面是两幅同学画的基因工程卡通图。你能像这位同学一样，展开你想像的翅膀，用图画、文字或用音乐创造等，来畅想基因工程的未来吗？
一、简述基因研究所取得主要成就，及其与基因工程创立与发展的关系。
1、基因学说的创立
孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论,揭示了在染色体上基因的线性排列.
2、DＮA是遗传物质
从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了ＤＮA的双螺旋模型及半保留复制机理，表明DＮA是遗传物质。
3、DNA是基因的载体
4、基因是细胞中ＲＮA及蛋白质的“蓝图”。
5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译，基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。
6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展,人们对基因的分子结构有了进一步的认识。
7、随着操纵子模型的提出,人们对基因的表达调控有了进一步的认识。
8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展，基因组文库、ｃDＮA文库、分子探针、PCＲ等技术不断被人们运用。
9、目前，不仅能够分离天然基因,还能结合化学合成等方法，在实验室内进行基因的合成、构建，并进行相应的表达分析。
基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科,它的创立和发展,直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步,基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。
二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么？并简述其在基因工程中的应用.
1、三大理论基础：
（1）1940年艾弗里（Ｏ。Ａvery)等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNＡ可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌;
(2）1９50年沃森(J。Ｄ。Watｓon)和克里克（Ｆ.Cｒicｋ）发现了ＤNＡ分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理;
(３）１960年关于遗传信息中心法则的确立。
2、三大技术条件:
(１）限制性内切核酸酶和ＤNA连接酶的发现;
（2)基因工程载体；
（3)大肠杆菌转化体系的建立。
3、应用：
通过限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以将切割得到的目的基因与载体连接在一起，经由大肠杆菌转化体系增值复制,为基因工程的后续研究提供基础材料。

三、什么是植物基因工程?什么是转基因植物?两者的关系如何?转基因作物对社会和经济发展的意义主要有哪些?
1、植物基因工程：用人工的方法，从不同生物中提取外源基因片段及载体ＤNA,经过体外切割、拼接和重组,然后采取某种方法，把重组后的带有外源基因的载体DNA引入植物细胞，并使其在植物细胞内进行复制和表达，以达到预期的改变受体植物细胞遗传特性的目的，此种过程即称为植物基因工程。
2、转基因植物：转基因植物是拥有来自其他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自不同物种之间的杂交，但今天该名词更多的特指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。通过植物基因工程中的重组DNA技术可以获得多种类型的转基因植物。
3、利用现代基因工程培育的转基因作物不仅克服了传统育种技术的种种局限性，大大提高了转基因的效率,加快了种质改良进程,而且打破了物种间的遗传壁垒,拓展了新品种研发可选择的特征范围，同时人工设计加工基因的应用则更进一步扩大了可利用的种质资源。转基因作物是人类按自己的主观意愿有目的、有计划、有根据、有预见地进行遗传修饰过的生物体,是现代生命科学发展的结晶，是人类从认识自然到改造自然的跃迁，标志着人类社会已经步入定向驾驭生物遗传改良的新时代。转基因作物将在彻底解决资源匮乏、环境恶化、顽症肆虐、粮食短缺等诸多威胁人类生存的难题上成为关键技术和支柱产业.

四、植物基因工程的主要环节有哪些？每个环节的主要任务是什么？
１、从供体生物分离克隆目标基因  
(1） 目标基因的遗传学研究、分子标记定位，或目标基因编码蛋白的纯化与测序； 
（2）构建基因组或ｃDNＡ文库； 
（3） 获得目标基因的探针或引物信息； 
（4） 标记探针,筛选文库获得目标基因，或直接通过PCR扩增目标基因; 
（5）目标基因克隆到质粒载体，转化大肠杆菌,目标基因的测序和分析；
（6）目标基因及其编码蛋白的进一步功能验证和分子鉴定。
２、构建工程载体
（1）采用特定的限制酶切割，从克隆载体上切下并回收目标基因;
（2）选取合适的转基因载体，并完成启动子、终止子等元件的亚克隆装载；
(3）采用相同的限制酶切割载体，使其末端与目标基因的末端相匹配;
(4)将目标基因与载体进行连接，形成重组表达载体。
3、转化大肠杆菌和重组载体的分子鉴定
(１）制备大肠杆菌感受态细胞;
(2）将重组载体转化大肠杆菌;　
（3)通过抗生素筛选获得大肠杆菌阳性菌落;　
（4）通过PＣR、限制酶切图谱分析、测序验证等，确认重组载体.
4、植物转化
一般采用农杆菌介导的二元载体转化法，将含有目标基因的T-DＮＡ片段导入受体植物细胞中，并整合到其染色体上；或采用基因枪法,直接将含有目标基因的ＤNA转化受体植物的器官；或采用病毒接种侵染方式,将目标基因转化受体植物的活体植株。针对标记基因进行筛选,通过组织培养获得再生植株,或收获活体转化母株上的种子。
5、鉴定和筛选转基因植株
（1)对再生植株进行分子鉴定,如PCR扩增、GＵＳ染色或GFＰ荧光检测和Southern杂交检测,得到确认外源基因转入并整合的阳性植株;
（２)对阳性植株进行ＲT－ＰＣR、Nｏrｔhern杂交、Westeｒn杂交等检测，得到外源基因高水平表达的转基因植株；　
(３)对转基因植株进行生物学鉴定与检测，确认背景性状是否改变和目标性状的改良程度，选择和保留最符合要求的转基因植株；
(4）繁殖转基因植株,并跟踪进行分子检测和生物学检测,获得目标性状和背景性状均稳定遗传的株系。
6、 转基因植物的安全性评价和产业化
（1）中间试验：向国家申请，在控制系统内或者控制条件下进行小规模试验,并取得合格。
（2)环境释放：向国家申请,在自然条件下采取相应安全措施进行中规模的试验,并取得合格。
（３)生产性试验：向国家申请,在生产和应用前进行较大规模的试验，最终取得安全证书.
（4)大规模推广种植转基因植物。

五、结合植物基因工程的实际应用，谈谈发展植物基因工程的潜力,及植物基因工程发展中应注意的问题。
１、21世纪植物基因工程的发展前景将是非常美好和令人鼓舞的.从研究进展和发展趋势来看，其热点将突出表现在以下几个方面：
（１）对基因功能的认识
目前，许多国家纷纷投入巨资针对主要的农作物(如水稻)构建其突变体库,然后利用转座子标签（Ｔｒａｎsposｏn taggiｎg）、T—ＤNA标签(Ｔ ＤNA ｔaｇginｇ)或图位克隆（ｍap ｂaｓed　clｏniｎｇ）技术分离和克隆基园，完成对基因功能的认识，从而全面获得功能性新基因并占有新基因的知识产权.现在，谁先了解基因的功能，谁就拥有了该基因的知识产权。因此，世界各国对基因的争夺日趋白热化。
（2）单基因抗性向多基因抗性转化
分子标记辅助选择育种可以实现多种基因的累加，将不同的抗性基因组合到同一品种中,培育出多抗或广谱的种质或品种。
（3)品质性状改良
包括：水果蔬菜的延熟保鲜；有益于健康的植物油（如不饱和脂肪酸）；增加营养价值（如维生素）；富含抗癌蛋白质的大豆;高营养的饲料(如高赖氨酸、表达植酸酶的玉米)；作物加工品质、外观、蒸煮食味品质和营养品质等方面。
（4）由质量性状向数量性状的转移
目前，科学家们正在通过分子标记等技术寻找与重要数量性状（如产量、品质等)相关的数量性状基因座(ＱＴL）,最终有可能通过育种程序将这些ＱTL集中起来加以利用。作物大多数重要的农艺性状均表现为数量遗传的特点，如产量、熟性和品质等。数量性状是传统育种的难点,是育种效率的重要制约因素。近年来,由于分子标记技术的迅速发展特别是完整遗传连锁图谱的建立，人们能够将数量性状分解成易为遗传育种工作者操作的单个位点即QTL进行研究。
（５)转基因技术的改进与提高
目前,在植物基因工程研究中还存在许多技术问题，如受体系统中普通存在的转基因沉默、转化频率低、转化植株后代遗传不稳定、转基因工程作物的生态风险性以及操作简便，费用低廉的转化系统的研制等，这将是今后基因工程研究中的热点问题。
2、植物基因工程发展中应注意以下问题:
(1）安全性问题,即转入的某一特性对最终产品使用的影响,特别是作为食品，对人体有无不良影响。
(2）转基因 DＮA的移动性,即这种 ＤNA是否会转至其他作物或杂草,因而引起环境及生态问题。
（3)对其他农业措施的后效应，对发展中国家农业及农产品出口的影响等。
(4)公众的接受性,即心理因素。

《基因工程及其应用》教案
【教学目标】
知识目标
掌握基因工程的概念、原理;基因操作的工具及其操作过程.
能力目标
培养学生分析、推理、归纳、总结的能力。
德育目标
培养学生实事求是的科学态度从现象到本质的科学的研究方法。
【教学重点】
基因工程的基本原理，基因操作的工具，基本步骤及其应用.
【教学难点】
基因工程的基本原理,基因工程的应用及其安全性。
【课时安排】1课时
【教学过程】
一、情境创设
提问:各种生物间的性状千差万别这是为什么呢?
引导:生物体的不同性状是通过基因特异性表达而形成的.
列举：几种生物的不同性状：够吐出丝;豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气；青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素.
提问:人类能不能改造性状?能不能使本身没有某个性状的生物具有某个特定性状呢？
引导：让禾本科植物能够固定空气中的氮气;能否让细菌“吐出”蚕丝；让微生物生产出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物。(这种设想能实现吗？)定向改造生物的新技术——基因工程。
二、师生互动
（1）基因工程的原理
指导学生阅读教材P102页第二段,通过提问的方式指导学生找出概念中的关键词语，并让学生理解基因工程概念,引导学生独立完成。最后归纳列表，便于学生的记忆.
概念：在生物体外,通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合,然后导入受