大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范_编制说明.doc

出入境检验检疫行业标准草案编制说明
编写模版（格式）

1 基本信息
1.1 标准名称
中文
大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范
英文
Protocol of quarantine for Gyrodactylus salaris of Atlantic salmon
1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况
等同
□修改
□非等效
标准号
OIE“Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2010”chapter2.3.3
英文名称
GYRODACTYLOSIS（Gyrodactylus salaris）
中文名称

1.3 任务来源
批准立项的文件名称和文件号
《关于组织申报2011年出入境检验检疫行业标准制（修）订计划项目的通知》（认办科函[2011]18号）
计划编号
2011B025
1.4 制（修）订情况
□制订
修订
替代的标准编号
SN/T 2124-2008
1.5 起止时间
2011年 1 月～ 2011 年 12 月
1.6 起草单位
中国检验检疫科学研究院
1.7 起草人
吴绍强、林祥梅、王彩霞、刘荭、岳志芹、贾广乐、刘建、张永宁、张旻、吕继洲
1.8 专业类别
1、食品（化妆品）检验；2、卫生检疫；3、√动物检疫；4、植物检疫；
5、纺织产品检验；6、轻工产品检验；7、机电产品检验；8、化工、矿产品和金属材料检验；9、管理；10、鉴定；11、包装与危险化学品
1.9 标准体系表代码

1.10 调整情况

2 背景情况
2.1 目的、意义
三代虫Gyrodactylus spp.隶属于扁形动物门吸虫纲单殖亚纲三代虫目三代虫科，是一类常见的鱼类体外寄生虫。主要寄生在鱼体表和鳃，广泛分布于世界各地海水和淡水水域，给渔业生产造成较大危害，已见报道的有400余种，主要危害鲢、鳙、草鱼、青鱼、鲫、鲤、团头鲂和鲇等多种淡水鱼，其中尤其是对鱼苗、鱼种的危害较大。大量寄生时，常引起病鱼大批死亡。三代虫身体细小延伸，具一对头器，没有眼点；有单细胞腺的头腺一对；口位于头器下方中央；体后端的后吸器发育良好，有一对中央大钩及背连结片与腹连结片各一，8对边缘小钩有秩序的排列着。三代虫用后吸器的大钩和小钩固着在寄主的身体上，同时前端的头腺也分泌粘液，用以粘着在寄主体上或慢慢爬行。边缘小钩刺入鱼体表，引起宿主鱼皮肤损伤，降低鱼体表抵抗力，继而引发疾病。三代虫的繁殖适温为20℃左右，所以该病主要发生在春秋季及初夏；感染途径主要是宿主间的直接接触感染。
近年来，随着渔业养殖密度不断提高，三代虫引起的疾病越来越严重。该病在我国各养鱼地区都有发生。大西洋鲑鱼三代虫的寄生数量很少时不导致任何临床症状。这种情况在鲑鱼中不多见；但在其他鲑鳟鱼中，特别是虹鳟鱼中则很常见、单个寄生虫的感染也是常见的，在这种情况下，它可以寄生在鱼体表的任何一个部位。因此在监测无症状鱼（即健康鱼）上的三代虫时，需要采取特别的步骤。通常情况下可以根据形态学，主要依据是形态、后吸器上钩及联结棒的形态和大小来对大西洋鲑鱼三代虫进行诊断。但是形态学鉴别对操作者要求比较高，操作者需要有相当丰富的形态学鉴别经验。近年来随着分子生物学技术的发展，PCR技术已经被广泛应用到多种动物疫病的检验检疫工作中，关于三代虫的分子生物学研究近年来也得到了飞速发展，可以通过DNA分析来鉴定，扩增核糖体的小亚单位的RNA基因的V4区域中358bp片段并通过测序来区别不同的三代虫；制备针对不同种三代虫的DNA探针，通过将待测样本产生的结果与用于对照的唇齿鳚三代虫、德氏三代虫和鳟三代虫的反应结果进行比较，可以鉴定种类；也可以先进行PCR扩增，然后通过测序来分析判断三代虫的种类。根据近几年来三代虫分子生物学研究的情况，本单位进行了更加深入的研究及方法的推广应用，总结检验检疫经验修定了大西洋鲑鱼三代虫的检疫标准。
本标准的修订，提高了大西洋鲑鱼三代虫口岸检疫的可操作性，同时利用分子生物学技术的优势，提高了大西洋鲑鱼三代虫检疫的敏感性和特异性。通过采取措施，
保证鱼类健康，起到重要作用。本方法能为检验检疫机构在进口鱼类检疫中检测这种寄生虫提供依据，并且是灵敏度高、特异性好的快速可靠的检测手段，避免引进携带该寄生虫的鱼苗、鱼种，维护国家利益，同时避免携带该寄生虫的鱼苗、鱼种出口国外，提高了我国对外贸易的国际声誉。
2.2 与国内外相关标准、文献的关系

国内行标SN/T 2124-2008《大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范》已经不符合当今口岸检验检疫现状，与国际动物卫生组织（OIE）颁布的2010版“GYRODACTYLOSIS（Gyrodactylus salaris）”不符，这与我国现代与国际接轨的发展浪潮脱节，因此本标准根据OIE的最新规定进行了修订，使其便于现场口岸检验检疫操作，有助于提高口岸检疫把关水平和质量。
三代虫（Gyrodactylus spp.）隶属于吸虫纲、单殖亚纲、三代虫目、三代虫科，是一类常见的鱼类体外寄生虫。主要寄生在鱼体表和鳃，广泛分布于世界各地海水和淡水水域，能寄生于绝大多数野生及养殖鱼类。三代虫对鱼类的危害以唇齿鳚三代虫（Gyrodactylus salaris）对挪威鲑科鱼的危害最为严重和典型。G.salaris是20世纪70年代从瑞典引种鲑鱼时带进挪威的，仅两年就使挪威野生大西洋鲑科鱼幼鱼数量下降了50%，1994年调查显示该三代虫已遍及挪威37条河流，37个渔场，挪威河的鲑鱼几乎全军覆没，鲑鱼养殖业遭到毁灭性打击。G.salaris在瑞典本土并未影响鲑鱼养殖业，而被引入挪威后，却对野生及养殖鲑鱼都造成了严重危害，因此，引起人们对鱼类三代虫病的口岸检疫的普遍关注。目前，G.salaris已被列为口岸检疫对象之一，其它种类的三代虫虽未被列为口岸检疫对象，但也应引起高度重视。我国关于三代虫的报道始于1948年，该病在我国各养鱼地区都有发生，其中以湖北、广东两省最严重，主要危害鲢、鳙、草鱼、青鱼、鲫、鲤、团头鲂和鲇等多种淡水鱼，其中尤其是对鱼苗、鱼种的危害较大。大量寄生时，常引起病鱼大批死亡。近年古雪夫三代虫引起的疾病在我国越来越流行，成为名特养殖鱼类——南方大口鲶苗种阶段的主要疾病，常造成大批死亡。
三代虫后吸器的几丁质构造和交配囊是形态学分类的主要依据。自分子生物技术应用于分类学依赖，对部分在形态学分类上存有异议的三代虫采用分子生物学手段进行确认。目前应用于三代虫种类识别的分子标记主要有18S rRNA基因中的V4区域、
rRNA基因重复单位中的内部转录间隔区1和2（ITS-1、ITS-2）。如：Zitara研究发上现G.arcuatus、G.branchicu的ITS-1和ITS-2表现了明显的种间差异；Cunningham发现G.salaris、G.derjavini和G.truttae在18S rRNA基因中V4序列上存在较大差异，可用于这几种三代虫的识别。此外，Jean等发现三代虫线粒体基因组之间虽然基因数量相近，但在基因组织排列方式以及基因表达模式等方面有明显差异，也可用于三代虫种类鉴别。目前由于部分三代虫种间形态及生物学特性差异很小，这给传统形态学分类造成一定困难，因此利用分子生物学方法从遗传物质上鉴别种类在某种程度上占有一定的优势。
3 编制过程
3.1 准备阶段（可选项）

3.2 分工情况
吴绍强：中国检验检疫科学研究院，主持标准的制订工作，具体负责相关科研工作及本标准的编写。
林祥梅：中国检验检疫科学研究院，负责协调标准的起草与标准体系的编写工作。
王彩霞：中国检验检疫科学研究院，负责鲑鱼三代虫DNA的提取及本标准部分内容的编写。
刘荭：深圳出入境检验检疫局，负责三代虫病流行病学的调查研究及样品的采集工作，为本标准的编写提供参考数据和材料。
岳志芹：山东出入境检验检疫局，负责三代虫病流行病学的调查研究及样品的采集工作，为本标准的编写提供参考数据和材料。
贾广乐：中国检验检疫科学研究院，负责鲑鱼三代虫通用PCR方法的建立。
刘建：中国检验检疫科学研究院，负责协调标准的起草与材料组织工作。
张永宁：中国检验检疫科学研究院，负责鲑鱼三代虫特异PCR方法的建立。
张旻：中国检验检疫科学研究院，负责鲑鱼三代虫检测方法的验证工作。
吕继洲：中国检验检疫科学研究院，负责病例的确诊、试验技术推广。
3.3 标准草案编写情况
本标准是由中国检验检疫科学研究院牵头，深圳出入境检验检疫局和山东出入境检验检疫局共同参与进行修订的行业标准。所制订的标准适用于养殖鱼类三代寄生虫的快速、灵敏检测。
所制订的标准包括范围、规范性引用文件、缩略语、设备、材料、试剂、样品的采集保存、操作方法、结果判定、规范性附录B和资料性附录A、C、D、E等内容，使大西洋鲑鱼三代虫的快速、灵敏检测标准化。
所修订的《大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范》标准将在多年进行三代虫检测的基础上，经过多家权威单位的验证试验和多样品的对比试验，经过充分的论证，确保该检测方法的科学性、实用性和先进性。在充分复核和验证的基础上，对PCR的反应条件进行了优化，形成了简便实用的快速、灵敏、标准化的检测方法，通过对检测流程的标准化，形成了本标准。
本标准在开展实验研究建立检测大西洋鲑鱼三代虫通用PCR和特异PCR检测方法的基础上，同时参照了GB/T 18088 《出入境动物检疫采样》，GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》，SN/T 1193《基因分析检测实验室技术要求》的要求进行编制。
本标准经过推广应用，所建立的标准检测方法快速、灵敏、特异性强，适合对鱼类三代虫进行检测。
3.4 征求意见情况（适用于送审稿）

3.5 审定情况
（适用于报批稿）

3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）

4 主要技术内容的确定
4.1采样及固定
将鱼带到实验室进行三代虫检查时，必须采集活鱼并放在鱼原生活的水中运输。一个容器只装运一种鱼。如果水质或水化学成分改变，三代虫会死亡或从宿主身体上掉下来。如果离开水，三代虫会很快死去，只要一死，通常它就会立即离开宿主。所以在冰中运输的死鱼不能用来作三代虫的检查，即使鱼是用塑料袋分装运来的。寄生虫在没有水时会立即死亡，因为这些寄生虫没有外骨骼，死去的寄生虫会与鱼的粘液和表皮细胞一样，很快就融解掉。
如果没有活鱼检查，一个较好的替代方法是检查用甲醛固定的鱼，或是酒精处理的鱼。固定鱼后甲醛的浓度应不低于4%（相当于10%的福尔马林）。这样，在放入鱼之前，甲醛的浓度应在8%~10%（相当于20%~25%的福尔马林），因为在固定过程中，有水从鱼体中释放出来。酒精在处理鱼以后的浓度应保持在大约70%。如果浓度较低，粘液和表皮有可能融解，三代虫即使被固定了，也有可能掉下来。然而，酒精的浓度也不能太高，否则鱼就会萎缩，难以检查。因此在放入鱼之前，建议酒精的浓度定在80%~85%之间为宜。在监测三代虫的标本时，甲醛固定的鱼比酒精固定的鱼要好一些，这是因为使用甲醛固定后，寄生虫的颜色变得更白一些，更容易检查到。
鱼应该固定在相对较大的标本瓶中，使其有足够的空间放固定液并留有余地（5~10倍）；瓶口要大，以防在取出鱼检查时可能刮掉三代虫；在固定鱼时，瓶子应该放平。当鱼固定2~3天后，瓶子要回到垂直位置。
4.2监测和初检
鱼应该放在具有良好光线的双筒解剖镜下逐条检查，在检查时，应该将鱼放在盛有运输时所用水的容器中，水应将鱼体完全淹没。活的寄生虫不停的运动，更容易被发现，在检查时，要避免折射光线在鱼体表的干扰。在杀死鱼时，应该用针刺鱼脑，以免鱼血将水污染。如果解剖镜用的是上光源，那么容器的底部就应该是黑色的，这样就会增加反差，以便更容易监测到寄生虫。必须检查整个鱼的体表，包括鳃和口腔，在这个过程中最好使用两把镊子。每条鱼必须至少检查5分钟。在检查体长于10厘米、没有被固定的小鱼的鳍条时，也可以用下光源的解剖镜，用这种方法通常很容易看到鳍条上的三代虫。
检查已固定的鱼标本与上述方法相似，将标本放在具有上光源的解剖镜下观察。在甲醛固定的鱼上，三代虫标本往往呈白色；而在酒精固定的鱼上，三代虫则常常呈轻微的昏暗颜色。在检查前应将鱼在自来水中清洗。可把装有鱼的容器放在自来水龙头下，让水流轻轻地通过容器冲洗约两个小时。在冲洗之前，先要分别检查固定鱼所用的固定剂，包括容器底部的沉淀物，看是否在固定和运输的过程中有三代虫从鱼
的身体上掉下来。为保护操作人员的身体健康，在检查时，解剖镜应放在具有下出风口的通风操作台上，以避免操作人员吸入挥发的固定剂。
4.3形态学鉴定
4.3.1属形态学鉴定
三代虫属体小而延伸，体长0.7-1.0mm。后吸器有1对中央大钩及背联结片与腹联结片各一，16个边缘小钩。其种类鉴定的依据是后吸器（即固着器）上边缘小钩、锚钩和联结棒的形态和形态测量数据。在鉴定种类之前，必须适当地对标本进行处理。
用Malmberg氏的苦味酸铵——甘油（APG）方法制作单殖吸虫等带吸盘的小蠕虫的标本。具体方法：先加一滴水到大小为76×26毫米的载玻片上，然后将一个寄生虫放到水滴上，并轻轻地在上面盖上盖玻片（大小为18×18毫米）。盖好玻片，用一块滤纸在盖玻片的边缘慢慢吸水，直到水基本吸干位置，注意水不要吸得太干，以免压碎虫体。接着滴一小滴APG到盖玻片的边缘，当黄色的APG溶液浸满盖玻片与载玻片的之间的空隙后，虫体就固定好了。最后，在玻片上做好标签，标签上要注明宿主种类、虫体的寄生部位、采集地点、采集日期和水温。在制作标本时最好用活的虫体，便于种类鉴定。
4.3.2鲑鱼三代虫的形态学鉴定
G.salari在形态学上和从褐鳟、大西洋鲑和虹鳟身上的G.teuchis和从河鳟身上的G.thymalli十分相似。这些种类的差别在于边缘小钩镰的形状。G.teuchis的钩镰要长而且更弯，G.thymalli的镰杆的角度要小一些。鲑鱼三代虫的形态测量及形态学描述见表1和图1、图2。但这些细小差别在鉴别种类时容易受到主观因素的影响，最好采用PCR扩增测序的方法来进行鲑鱼三代虫的种类鉴定。
表1 鲑鱼三代虫的边缘小钩、锚钩和腹联结棒中14种特征数据的总变动范围
虫体来自鲑的幼鱼和虹鳟；进行虫体测量时的水温在0.0℃~20.0℃；测量单位为微米。
测量的特征
变动范围
边缘小钩全长
33.0~46.6
边缘小钩柄部长
26.0~38.5
边缘小钩镰部长
7.0~9.5
锚钩全长
58.0~85.0
锚钩柄部长
42.8~63.9
锚钩尖部长
27.8~44.2
锚钩基部长
15.0~32.1
腹联结棒两凸起间的最大长度
18.5~33.2
腹联结棒长
19.5~32.0
腹联结棒基部总宽度
20.3~36.5
腹联结棒基部宽度
7.1~18.7
腹联结棒中间总宽度
17.0~35.5
腹联结棒中间宽度
5.0~15.5
腹联结棒膜长
12.5~23.0

图1鲑鱼三代虫后吸器固着结构的形态变异
注：左侧线段长度分别为40μm、50μm和30μm。a）：边缘小钩；b）：锚钩；c）：腹联结棒。

图2鲑鱼三代虫的边缘小钩、锚钩和腹联结棒中14种测量特征
注：lmh——边缘小钩全长；lh——边缘小钩柄部长；lsi——边缘小钩镰部长；la——锚钩全长；las——锚钩柄部长；lap——锚钩尖部长；lar——锚钩基部长；mdpvd——腹联结棒两凸起间的最大长度；lvb——腹联结棒长；tbwvb——腹联结棒基部总宽度；bwvb——腹联结棒基部宽度；tmwvb——腹联结棒中间总宽度；mwvb——腹联结棒中间宽度；lvbm——腹联结棒膜长；tmwvb——mwvb+lvbm。
4.4三代虫的PCR检测方法
4.4.1样品制备
可采用从新鲜鱼体表采集的可疑虫体。
可采用酒精固定样品，把样品从酒精中取出，去掉多余的酒精后放在0.5毫升的离心管里。管中有7.5微升裂解液（0.45%NP40，0.45%吐温-20，6μg/mL蛋白酶K）。离心管于65℃作用20分钟，再95℃加热10分钟。该裂解产品不需要进一步纯化就可以用作PCR模板。除检测样品外，还应设立以下对照：
——取已知三代虫样品作为阳性对照；
——取健康鱼组织样品作为阴性对照。
4.4.2三代虫通用PCR扩增
4.4.2.1引物：
针对三代虫内部转录间隔区（ITS）基因序列的通用PCR引物序列如下：
上游：5’-TTTCCGTAGGTGAACCT-3’
下游：5’-TCCTCCGCTTAGTGATA-3’
上述引物合成后均用ddH2O稀释至10μM，-20℃保存备用。预期片段长度为1300bp。
4.4.2.2反应体系
在PCR管内加入10×Buffer（含Mg2+）2.5μL，dNTP（各2.5mM）2.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，rTaq（5U/μL）0.5μL，模板DNA2μL ，ddH2O补充至25μL反应体系。
4.4.2.3反应条件：
95℃预变性5min；95℃，1min，55℃，1min，72℃，2min，35个循环；72℃，延伸7min。
4.4.2.4琼脂糖电泳
取5μL样品PCR扩增产物，进行1%-2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪或者紫外透射仪观察结果。
4.4.3大西洋鲑鱼三代虫特异PCR扩增
4.4.3.1引物：
针对大西洋鲑鱼三代虫细胞色素氧化酶（CO1）基因序列的特异PCR引物序列如下：
上游：5’-TAATCGGCGGGTTCGGTAA-3’
下游：5’-GAACCATGTATCGTGTAGCA-3’
上述引物合成后均用ddH2O稀释至10μM，-20℃保存备用。预期片段长度为893bp。
4.4.3.2反应体系：
在PCR管内加入10×Buffer（含Mg2+）2.5μL，dNTP（各2.5mM）2.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，rTaq（5U/μL）0.5μL，模板DNA2μL ，ddH2O补充至25μL反应体系。
4.4.3.3反应条件：
95℃预变性5min，95℃，1min，50℃，1min，72℃，2min，35个循环；72℃延伸7min。
4.4.3.4琼脂糖电泳
取5μL样品PCR扩增产物，进行1%-2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪或者紫外透射仪观察结果。
4.4.4结果判定
4.4.4.1三代虫通用PCR检测：
在阴阳性对照成立的前提下，若样品在1300bp处有目的条带，通过测序，Blast比对序列可以区分G. derjavini, G. derjavinoides, G. truttae, G. teuchis、G.thymalli（G.salaris）等三代虫种类，但是不能通过比对序列来区别G.salaris和G.thymalli。若样品在1300bp处无目的条带，则判定样品为三代虫核酸阴性。
4.4.4.2大西洋鲑鱼三代虫特异PCR检测：
在阴阳性对照成立的前提下，若样品在893bp处有目的条带，通过测序，进行系统进化树分析，可以发现G.salaris和G.thymalli分别在不同的进化支上，从而将G.salaris同G.thymalli区别开来。
4.5结果综合判定
4.5.1初检
如果在鲑科鱼的体表或鳍条肉眼观察到虫体，可借助于显微镜观察虫体形态对其进行初检，根据后吸器的形态确定为三代虫属。
对于形态学不能鉴定的虫体，可借助三代虫通用PCR检测进行初筛，若样品在1300bp处有特异性扩增条带，则判为三代虫核酸阳性。
4.5.2确诊
对于初筛的样品，可进行CO1基因的PCR扩增，对PCR产物进行测序结合在线BLAST分析以及系统进化树分析，最终确诊是否为G.salaris。
5 验证情况（适用于方法类标准）
5.1 验证单位情况
验证单位
验证人员
验证时间

5.2 验证过程

5.3 验证数据分析

5.4 验证评价

5.5 其他应说明的情况
本标准的修订是根据OIE制订的2010版“GYRODACTYLOSIS（Gyrodactylus salaris）进行的，无须进行验证评价工作。
6 附加说明（可选项）
6.1 宣贯标准的建议

6.2 修订和废除现行有关标准的建议

6.3 作为强制性标准或推荐性的建议

6.4 其他需要说明的情况

6.5 参考文献

联系人

联系电话

电子邮箱

注1：本模版表的共性部分为第1章、第2章、第4章和第6章。
注2：3.4适用于标准草案送审稿，3.5适用于标准草案报批稿，3.6中预期的管理目标适用于规程类标准，3.6中技术指标适用于方法类标准，第5章适用于方法类标准编制说明的编写。
注3：3.1和第6章为可选项，其余为必填项。
编写日期： 年 月 日

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