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资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。广州市玉岩中学校本课程微生物实验技术 ”科技教育特色项目”微生物纯化项目配套教材唐红梅编前 言 广州市玉岩中学生物科组申报到了第五批广州市学校”科技教育特色项目”- ”微生物纯化研究项目”, 配合此项目特编写微生物实验技术一书, 以便较为系统地教会参赛学生一些基本的微生物实验操作技术, 为其进一步发展奠定一定的基础。本课程的主要内容有清洁玻璃器皿、 灭菌方法、 培养基的制备、 微生物的分离和纯化实验、 选择性培养基筛选目的菌株实验、 革兰氏染色法、 微生物菌种的保藏等。具体如下: 内容序号实验项目名称基本实验技能1清洁玻璃器皿2灭菌方法3培养基的制备微生物的分离、 筛选与纯化4微生物的分离和纯化实验5选择性培养基筛选目的菌株实验微生物的保藏6微生物菌种的保藏微生物的鉴定方法7革兰氏染色法、 附常见培养基配方、 染色法及染色液的配制 编者 10月实验一 清洁玻璃器皿( 1) 一般的玻璃仪器( 如烧瓶、 烧杯等) : 先用自来水冲洗一下, 然后用肥皂、 洗衣粉用毛刷刷洗, 再用自来水清洗, 最后用纯化水冲洗3次( 应顺壁冲洗并充分震荡, 以提高冲洗效果) 。计量玻璃仪器( 如滴定管、 移液管、 量瓶等) : 也可用肥皂、 洗衣粉的洗涤, 但不能用毛刷刷洗。( 2) 精密或难洗的玻璃仪器( 滴定管、 移液管、 量瓶、 比色管、 玻璃垂熔漏斗等) : 先用自来水冲洗后, 沥干, 再用铬酸清洁液处理一段时间( 一般放置过夜) , 然后用自来水清洗, 最后用纯化水冲洗3次。( 3) 洗刷仪器时, 应首先将手用肥皂洗净, 免得手上的油污物沾附在仪器壁上, 增加洗刷的困难。( 4) 一个洗净的玻璃仪器应该不挂水珠( 洗净的仪器倒置时, 水流出后器壁不挂水珠) 。实验二 灭菌方法将物体上的所有微生物包括细菌芽孢全部杀死或除去的措施。灭菌的方法有加压灭菌、 紫外线照射灭菌、 过滤除菌和化学药剂灭菌。应用灭菌技术可对接种室、 玻璃器皿、 发酵罐、 培养皿等进行灭菌, 这是进行微生物学研究和微生物工业生产所不可缺少的。一、 常见的灭菌方法有: ( 一) 干热灭菌1.焚烧: 是一种彻底的灭菌方法, 但仅适用于废弃物品或尸体等。2.烧灼: 直接用火焰灭菌, 适用于微生物学实验室的接种环、 试管口等的灭菌. 3.干烤: 用烤箱灭菌。一般加热至160170经2小时。适用于高温下不变质、 不蒸发的物品, 如玻璃器皿、 瓷器等。( 二) 湿热灭菌 1.煮沸法: 1个大气压下, 煮沸的水温为100, 一般细菌繁殖体煮沸5分钟即被杀死。细菌芽胞常需煮沸12小时, 才被杀死。水中加入 2%碳酸钠, 既可提高沸点达105, 促进细菌芽胞的杀灭, 又可防止金属器皿生锈。2.巴氏消毒法:用较低温度杀灭液体中的病原菌、 同时又不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。加热61.162.8半小时即可, 常见于牛奶和酒类等的消毒。3. 间歇灭菌法:是利用重复多次的流通蒸汽加热, 杀死细菌所有繁殖体和芽胞的灭菌法。具体做法是将待灭菌的物品置于阿诺流通蒸汽灭菌器内, 100 加热1530分钟, 杀死其中的细菌繁殖体, 然后将物品置于37温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体, 次日再经过流通蒸汽加热, 如此连续三次, 可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。4.高压蒸汽灭菌法: 是灭菌效果最好、 当前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅高压蒸汽灭菌器内进行的。加热时蒸汽不能外溢, 容器内温度随蒸汽压的增加而升高, 杀菌力也大为增强。一般在1.05kg/cm2的压力下, 温度达121.3,维持1530分钟, 可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。此法适用于耐高温和不怕潮湿物品的灭菌 ( 三) 滤器除菌凡是具有生物活性的物质, 要保持生物活性一般都不能用高压灭菌。生物素及组氨酸溶液也只能用滤器除菌。二、 选择消毒、 灭菌方法的原则根据物品污染后的危害程度选择消毒、 灭菌的方法。( 1) 高度危险的物品: 必须选用灭菌方法处理。( 2) 中度危险性物品: 一般情况下达到消毒即可, 可选用中水平或高水平消毒法。但中度危险性物品的消毒要求并不相同, 有些要求严格。( 3) 低度危险性物品: 一般可用低水平消毒方法, 或只做一般的清洁处理即可, 仅在特殊情况下, 才作特殊的消毒要求。例如, 当有病原微生物污染时, 必须针对污染病原微生物的种类选用有效的消毒方法。3.根据物品上污染微生物的种类、 数量和危害性选择消毒、 灭菌方法。( 1) 对受到细菌芽胞、 真菌孢子、 分枝杆菌和经血传播病原体( 乙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒、 艾滋病病毒等) 污染的物品, 选用高水平消毒法或灭菌法。( 2) 对受到真菌、 亲水病毒、 螺旋体、 支原体、 衣原体和病原微生物污染的物品, 选用中水平以上的消毒法。( 3) 对受到一般细菌和亲脂病毒等污染的物品, 可选用中水平或低水平消毒法。( 4) 对存在较多有机物的物品消毒时, 应加大消毒药剂的使用剂量和( 或) 延长消毒作用时间。( 5) 消毒物品上微生物污染特别严重时, 应加大消毒剂的使用剂量和( 或) 延长消毒作用时间。4.根据消毒物品的性质选择消毒方法 选择消毒方法时需考虑, 一是要保护消毒物品不受损坏, 二是使消毒方法易于发挥作用。( 1) 耐高温、 耐湿度的物品和器材: 应首选压力蒸气灭菌; 耐高温的玻璃器材、 油剂类和干粉类等可选用干热灭菌。( 2) 不耐热、 不耐湿, 以及贵重物品: 可选择环氧乙烷或低温蒸气甲醛气体消毒、 灭菌。( 3) 器械的浸泡灭菌: 应选择对金属基本无腐蚀性的消毒剂。( 4) 选择表面消毒方法: 应考虑表面性质, 光滑表面可选择紫外线消毒器近距离照射, 或液体消毒剂擦拭; 多孔材料表面可采用喷雾消毒法。微生物对消毒因子的敏感性一般认为, 微生物对消毒因子的敏感性从高到低的顺序为: 1.亲脂病毒( 有脂质膜的病毒) 如乙型肝炎病毒、 流感病毒等。2.细菌繁殖体。3.真菌。4.亲水病毒( 没有脂质包膜的病毒) 如甲型肝炎病毒、 脊髓灰质炎病毒等。5.分枝杆菌: 例如结核分枝杆菌、 龟分枝杆菌等。6.细菌芽胞: 例如炭疽杆菌芽胞、 枯草杆菌芽胞等。7.朊毒( 感染性蛋白质) 。实验三 培养基的制备一、 目的学会和掌握培养基的配制方法二、 实验原理: 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、 氮源、 无机盐、 生长因素、 能源和水。根据微生物的种类和实验目的不同, 培养基要选择合适的配比关系; 选择合适的理化性质; 配后要及时灭菌。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基, 有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质, 因此可供细菌生长繁殖之用。高压蒸汽灭菌方法主要是经过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常见的分离、 纯化方法: 单细胞挑取法, 稀释涂布平板法, 稀释混合平板法, 平板划线法等。三、 实验内容: 1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备( 1) 计算根据配方计算出实验中各种药品所需要的量, 然后再分别称量。( 2) 称量准确称取各种成分。一些不易称量的成分如牛肉膏, 可用玻璃棒取出放硫酸纸上称量, 然后连同硫酸纸一起放入烧杯中。( 3) 溶解向烧杯内加入所需的水量, 将牛肉膏用水洗下后, 取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍放冷。( 4) 调pH值用酸度计或精密pH试纸测定其pH值, 并用10NaOH调至所需pH值, 必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2, 因为高压蒸汽灭菌后, pH常降低。( 5) 分装根据不同需要, 可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基, 应装试管高度的1/4左右; 固体培养基装试管高度的1/5左右; 装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。( 6) 包扎试管扎成捆。试管和三角瓶的棉塞外用硫酸纸和牛皮纸包扎, 纸上表明培养基的名称、 配制日期等。( 7) 灭菌培养基用0.1Mpa高压蒸汽灭菌1520min。2.培养基的高压蒸汽灭菌灭菌原理: 水的沸点可随压力的增加而提高, 当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时, 因锅是密闭的, 蒸汽不能溢出, 而使压力增加, 水的沸点和温度也随之增加。因此, 高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生的高温, 以及热蒸汽的穿透能力来达到灭菌的目的。一般在0.1Mpa的压力时, 温度可达121只要维持1520min, 就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。灭菌方法: ( 1) 加水于灭菌器内到规定的水平面。( 2) 需灭菌的物品( 分装在试管、 三角烧瓶中的固、 液体培养基) , 棉塞、 硅胶泡沫塞等用防潮纸包好( 防止锅内水汽把棉塞淋湿) , 放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松, 不可太挤, 否则阻碍蒸汽流通, 影响灭菌效果。( 3) 将灭菌锅盖的排气管插人套筒侧壁的凹槽内, 关闭灭菌锅盖旋紧螺栓, 切勿漏气。( 4) 打开放气阀, 加热, 热蒸汽上升, 以排除锅内冷空气, 排气约5l0min, 关闭放气阀。( 5) 关闭放气阀后, 整个灭菌锅成为密闭状态, 而蒸汽又不断增多, 这时压力和温度都上升, 直至压力表指针达到所需压力时, 开始计时, 经过调节热源, 维持此压力到所需时间。( 6) 灭菌完毕, 待压力自然降至0时, 打开放气阀, 注意不能打开过早, 否则突然降压致使培养基冲腾, 使棉塞、 硅胶泡沫塞沾污, 甚至冲出容器以外。 ( 7) 打开灭菌锅盖, 取出已灭菌的器皿及培养基。( 8) 灭菌锅用完后, 将锅内剩余的水倒掉, 以免日久腐蚀。3. 注意事项(1)要严格按配方配制。(2)调pH不要过头。(3)高压灭菌要注意物品不要过多, 加热后排除冷空气, 到时降压回零取物。 实验四 微生物的分离和纯化一、 目的 学习和掌握微生物的分离和纯化的基础操作技术二、 原理在土壤、 水、 空气或人及动、 植物体中, 不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起, 当我们希望获得某一种微生物时, 就必须从混杂的微生物类群中分离它, 以得到只含有这一种微生物的纯培养, 这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得某种微生物的纯培养, 一般是根据该微生物对营养、 酸碱度、 氧等条件要求不同, 而供给它适宜的培养条件, 或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长, 而抑制其它菌生长的环境, 从而淘汰其它一些不需要的微生物, 再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、 纯化该微生物, 直至得到纯菌株。土壤是微生物生活的大本营, 在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的, 因此, 土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地, 能够从其中分离、 纯化到许多有用的菌株。三、 器材高氏1号琼脂培养基, 肉膏蛋白胨琼脂培养基, 马丁氏琼脂培养基, 盛9ml无菌水的试管, 盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶, 无菌玻璃涂棒, 无菌吸管, 接种环, 10酚, 无菌培养皿, 链霉素, 土样等。四、 操作步骤1稀释涂布平板法(1)倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、 高氏1号琼脂培养基、 马丁氏琼脂培养基溶化, 待冷至5560时, 向高氏1号琼脂培养基中加入10酚数滴, 向马丁氏培养基中加入链霉素溶液, 使每毫升培养基中含链霉素30g。然后分别倒平板, 每种培养基倒三皿, 其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶, 置火焰旁边, 左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞, 用手掌边缘和小指、 无名指夹住拔出, 如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完, 则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管(瓶)口在火焰上灭菌, 然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝, 迅速倒入培养基约15ml, 加盖后轻轻摇动培养皿, 使培养基均匀分布, 平置于桌面上, 待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上, 用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿, 再注入培养基, 摇匀后制成平板。最好是将平板放室温23天, 或 37培养24小时, 检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。(2)制备 土壤稀释液称取土样10g, 放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中, 振摇约20分钟, 使土样与水充分混合, 将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中, 吹吸三次, 使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中, 以此类推制成10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6各种稀释度的土壤溶液。(3)涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、 10-5和10-6三种稀释度, 然后用三支1ml无菌吸管分别由10-4、 10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中, 用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。(4)培养 将高氏1号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28温室中培养35日, 肉膏蛋白胨平板倒置于37温室中培养23日。(5)挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上, 分别置28和37温室中培养, 待菌苔长出后, 检查菌苔是否单纯, 也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物, 若有其它杂菌混杂, 就要再一次进行分离、 纯化, 直到获得纯培养。2稀释混合平板法此法与稀释涂布平板法基本相同, 无菌操作也一样, 所不同的是先分别吸取05ml10-4、 10-5、 10-6稀释度的土壤悬液对号放入平皿, 然后再倒入溶化后冷却到45左右的培养基, 边倒入边摇匀, 使样品中的微生物与培养基混合均匀, 待冷凝成平板后, 分别倒置于28和37温室中培养后, 再挑取单个菌落, 直至获得纯培养。3平板划线分离法(1)按稀释涂布平板法倒平板, 并用记号笔标明培养基名称。(2)划线在近火焰处, 左手拿皿底, 右手拿接种环, 挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多, 但无论哪种方法划线, 其目的都是经过划线将样品在平板上进行稀释, 使形成单个菌落。常见的划线方法有下列二种: (a)用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环, 先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条, 再转动培养皿约70角, 并将接种环上剩余物烧掉, 待冷却后经过第一次划线部分作第二次平行划线, 再用同法经过第二次平行划线部分作第三次平行划线和经过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后, 盖上皿盖, 倒置于温室培养。(b)将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后, 盖上皿盖, 倒置温室培养。(3)挑菌 同稀释涂布平板法, 一直到菌分纯为止。五、 实验结果分析实验五 选择性培养基筛选目的菌株实验 一、 实验目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和方法二、 原理产-甘露聚糖酶的菌株能分泌到菌落周围的培养基中, 从而水解培养基的甘露聚糖、 葡萄甘露聚糖、 半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的酶等半纤维, 由于使用的经刚果红标记的魔芋精粉, 当魔芋精粉被-甘露聚糖酶作用后便形成分子量小、 可溶且交易扩散的水解物, 从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈, 而透明圈的大小能够反应酶活性的高低。三、 材料、 试剂和仪器1、 菌的来源 玉岩后山树木园里采集几处土样( 离表土层11cm 左右) 2、 主要化学试剂魔芋精粉(成都魔芋精粉厂) 、 刚果红( 上海伯奥生物科技有限公司) 、 无菌水和琼脂粉等3、 仪器设备SW-CJ-1B标准型净化工作台、 生化恒温培养箱、 电热恒温培养箱 、 HIRAYAMA灭菌锅、 电热恒温鼓风干燥箱、 电子天平四、 方法与步骤1、 培养基及其制备LB培养基: 蛋白胨1g 酵母膏0.5 g 氯化钠1g dH2O 100ml pH 7.0富集培养基: 魔芋精粉 4g MgCl2.6H2O 0.02g K2HPO4.3H2O 0.1g KNO3 0.05g dH2O 100ml 自然pH筛选培养基: 魔芋精粉 1g 琼脂粉1.5 g MgCl2.6H2O 0.02g K2HPO4.3H2O 0.1g KNO3 0.05g dH2O 100ml pH 7.2-7.4-甘露聚糖酶活性检测培养基: RBV-魔芋精粉 1.5g 琼脂粉1.5g dH2O 100ml pH7.2-7.2、 器皿与培养基的灭菌培养皿、 牙签、 塞刻度试管、 滴管等四层报纸包好121下灭菌20min, 备用。3、 土样的采集与稀释 在玉岩后山树木园里采集几处土样( 离表土层11cm 左右) , 混匀后过40目筛, 去除小石头及过粗颗粒。称取1g加入装有100ml无菌水的三角瓶中, 用力摇匀后静置上10分钟后, 取1ml澄清的上层液于无菌具塞试管中, 用无菌水定容至10ml, 同理依次得到10-4、 10-5、 10-6、 10-7稀释液, 分别取10-6、 10-7稀释液200l, 与50的3%充分溶胀的魔芋精粉混匀后置于37恒温箱中培养4、 菌种的初筛、 富集48小时后挑出液化现象明显的培养基, 取100l培养液适当稀释后, 以-甘露聚糖酶活性检测培养基快速检测酶活的有无和大小( 40, 温育1 h) ; 吸取酶活最高的培养液1ml用2%的富集培养基25ml的作富集培养, 同样方法连续培养五次以后, 取适当稀释倍数的菌液100l均匀涂布在筛选培养基上, 置于37恒温箱中培养18小时后 采用棉绒垫影印法和刚果红染色法, 挑出具透明圈的单菌落。5、 产酶菌株的筛选分离、 纯化 挑取出现透明圈的单菌落平板划线, 相同条件下培养至透明圈出现, 以后按同样方法进行复筛, 重复6次以后, 得到纯化菌株。五、 结果的处理与分析1、 菌落产生透明水解圈的观察 用直尺分别与不同方向测量菌落和水解圈的直径大小, 求平均值, 计算透明水解圈直径与菌落直径的比值。2、 候选菌落的形态观察六、 注意事项1、 实验过程中避免说话、 走动2、 注意实验仪器与用具的消毒3、 每次接种针或涂布棒要灼烧灭菌, 冷却后再涂下一块板实验六 革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法, 1884年由丹麦医师、 细菌学家 Christain Gram创立。 细菌先经碱性染料结晶染色, 而经碘液媒染后, 用酒精脱色, 在一定条件下有的细菌此色不被脱去, 有的可被脱去, 因此可把细菌分为两大类, 前者叫做革兰氏阳性菌( G+) , 后者为革兰氏阴性菌( G) 。为观察方便, 脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、 稀释复红等进行复染。阳性菌仍带紫色, 阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌, 以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应; 弧菌, 螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。革兰氏阳性菌对青霉素敏感, 革兰氏阴性菌对链霉素敏感。可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别, 染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物, 它与碘和结晶紫的复合物结合很牢, 不易脱色, 阴性菌复合物结合程度底, 吸附染料差, 易脱色, 这是染色反应的主要依据。 另外, 阳性菌菌体等电点较阴性菌为低, 在相同PH条件下进行染色, 阳性菌吸附碱性染料很多, 因此不易脱去, 阴性菌则相反。因此染色时的条件要严格控制。例如, 在强碱的条件下进行染色, 两类菌吸附碱性染料都多, 都可呈正反应; pH很低时, 则可都呈负反应。另外, 两类菌的细胞壁等对结晶紫碘复合物的通透性也不一致, 阳性菌透性小, 故不易被脱色, 阴性菌透性大, 易脱色。因此脱色时间, 脱色方法也应严格控制。 染色原理G+菌: 细胞壁厚, 肽聚糖网状分子形成一种透性障, 当乙醇脱色时, 肽聚糖脱水而孔障缩小, 故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 G菌: 肽聚糖层薄, 交联松散, 乙醇脱色不能使其结构收缩, 其脂含量高,乙醇将脂溶解, 缝隙加大, 结晶紫-碘复合物溶出细胞壁, 番红染液复染后呈红色。 操作流程革兰氏染色法一般包括初染、 媒染、 脱色、 复染等四个步骤, 具体操作方法是: ) 涂片固定。在无菌操作条件下, 用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀, 固定。 ) 草酸铵结晶紫染1分钟。 ) 自来水冲洗, 去掉浮色。 ) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟, 倾去多余溶液。 ) 用中性脱色剂如乙醇( 95%) 或丙酮酸脱色30秒, 革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色, 革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。 ) 用蕃红染液复染30秒, 革兰氏阳性菌仍呈紫色, 革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。 实验七 微生物菌种的保藏方法一、 菌种的保藏方法 (一)定期移植保藏法定期移植保藏法又称传代培养保藏法, 包括: 斜面培养、 液体培养、 穿刺培养等, 是最早使用而且现今依然普遍采用的方法。操作方法: 将菌种接种于适宜的培养基中, 最适温度下培养, 待长出健壮菌落, 置温度4 6 、 相对湿度60 70的条件下保藏, 而且每隔一定时间移植培养1次。定期移植的时间, 随微生物的种类不同而异。一般来说, 不产芽孢的细菌每月移植1次, 芽孢细菌每3个月移植1次; 放线菌、 酵母菌、 霉菌和食用菌每36个月移植1次。该法便于操作, 不需特殊设备, 并可随时观察菌种的变异、 退化、 污染、 死亡现象。可是, 菌种在长期保藏中频繁移植传代, 易变异退化, 并有杂菌污染的危险。(二)矿油封存法矿油封存法又称液体石蜡封存法, 系为定期移植保藏法的辅助方法。具体方法: 将化学纯的液体石蜡经121灭菌30 min后, 注入试管斜面培养物上, 使液面高出试管斜面1 cm, 试管口盖上胶塞, 以直立状态将试管斜面菌种排放在试管架上, 置温度4 l5 、 干燥条件下保藏。使用时, 到去液体石蜡, 用无菌水洗涤斜面菌种12次, 进行接种。试管斜面菌种采用矿油封存, 防止了培养基中水分的蒸发, 隔绝了菌种与氧的接触, 降低了微生物的代谢活性, 使保藏期较定期移植法延长。(三)蒸馏水或溶液悬浮保藏法蒸馏水或溶液悬浮保藏法是一种简单的菌种保藏法, 系指将微生物细胞悬浮在蒸馏水或蔗糖、 葡萄糖、 磷酸、 食盐等溶液中, 置低温下封存保藏的方法。菌种悬浮的方法有: 细胞悬浮法和菌块悬浮法。1细胞悬浮法取试管斜面或平板菌落1菌环, 移入已灭菌的5 ml蒸馏水或溶液试管中, 使细胞在蒸馏水或溶液中分散, 盖上灭菌胶塞, 置l0 条件下保藏。恢复活性时, 从试管中移出1菌环于新鲜培养基中, 而原试管悬浮菌种加塞后可继保藏。2、 茵块悬浮法从平板培养的丝状真菌菌落边缘切取约6 mm见方的小块, 连同琼脂一起悬浮于无菌的5 ml蒸馏水或溶液试管中, 盖上灭菌胶塞, 置10 条件下保藏。恢复活性时, 从试管中移出1小块于新鲜培养基中, 而原试管悬浮菌种加塞后可继续保藏。采用蒸馏水或溶液悬浮法保藏某些细菌该法操作简便, 效果较好( 四)液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法简称液氮保藏法。签于真空冷冻干燥法不易保藏不产孢子的丝状真菌(如食用菌中的某些担子菌)和高度组织化的高等生物细胞的事实, 特别是近年来的研究发现, 真空冷冻干燥法对某些生物具有致突变作用, 因而更加促进了液氮超低温保藏技术的发展。1949年, 英国低温冷冻精子获得成功; 1956年MERYMAN提出: 一130 是生物化学反应和生物变异的终止点, 由此推断, 能经受超低温冷冻及其后融化的生物, 在一130 或更低的液氮温度下可能无限期地保持原有的生物学性状而存活; 60年代以后, 受液氮保藏高等生物细胞的启发, 开始探索液氮超低温冷冻技术保藏微生物菌种, 至今已取得了许多成功的经验。当前, 液氮保藏法被认为是长期保藏所有微生物菌种最为有效的方法。液氮保藏法保藏微生物菌种的主要设备和器具有: 液氮发生器(生产制造液氮的设备)、 液氮贮存罐(盛纳液氮的容器, 定期向液氮冰箱中补充液氮)、 液氮生物贮存罐(即液氮冰箱, 用于保藏安瓶管菌种)、 控速冻结器(控制安瓶管菌种冻结速度的仪器)、 安瓶管(装有菌种悬液的小试管)、 铝夹(固定安瓶管的铝制长形夹卡)等。利用该法可达到长期保藏微生物菌种的目的, 效果良好。但需要定期向液氮冰箱中补充液氮, 费用较高, 运输不方便。( 五)干燥保藏法1普通干燥保藏法 在液氮超低温冷冻技术和真空冷冻干燥技术尚未广泛应用于菌种保藏之前, 多采用普通干燥法保藏菌种。普通干燥保藏法系利用干燥的原理保藏菌种, 即将微生物细胞或孢子吸附在容易干燥的载体上, 干燥后保藏。根据载体不同, 有砂土管保藏法、 滤纸片保藏法、 明胶或硅胶保藏法、 麸皮保藏法等, 虽然形式不同, 但原理和操作程序类似, 现只介绍砂土管保藏法。(1)砂土管的制备: 取河砂, 过60 目筛, 10 盐酸浸泡24h, 水冲洗至中性, 烘干备用; 取果园土, 风干、 粉碎, 过60 目筛备用; 将砂与土按2: 1(ww)混合, 分装安瓶管(10100 ram)1cm 厚, 塞好棉塞, 121 灭菌30 rain备用。(2)菌种悬液的制备: 在培养好的试管斜面培养物中加入蒸馏水3 mL, 洗下细胞或孢子, 制成菌种悬液。(3)菌种悬液与载体混合: 用无菌吸管将菌种悬液滴入砂土管中, 每管10滴, 摇均。(4)干燥: 将砂土管菌种放入底部盛有P2 O5的干燥器中, 待P, O 吸水成糊后更换, 重复数次, 砂土管菌种即可干燥。(5)保藏: 砂土管干燥后, 仍可在干燥器内保藏或将砂土管熔封后保藏。由于细菌的芽孢、 放线菌和真菌的孢子耐干燥, 因而, 该法适宜保藏芽孢细菌、 放线菌和产孢真菌。2真空干燥保藏法 真空干燥保藏法是利用干燥、 隔氧的原理保藏菌种, 即将微生物细胞或孢子与保护剂混合制成悬液, 直接真空干燥, 再经真空封存后保藏。由于菌种悬液不经冻结而直接真空干燥, 因而又称L一干燥法或称液体直接干燥法。该法由ANNEAR 于1958年建立。真空干燥法保藏菌种的装置为: 在真空泵与多歧管相连的管路上安装热电偶真空计和冷凝器(水分收集器, 内有P2 O5), 多歧管经过密封圈和螺圈帽与安瓶管相连, 安瓶管下面设置水浴槽保温。该法适合保藏对冷冻比较敏感的微生物菌种, 而且大多数细菌采用此法保藏存活率较低。3真空冷冻干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法简称冻干法, 即将微生物细胞或孢子与保护剂混合制成悬液, 在共溶点以下预冻, 然后, 在低于三相点压力的高度真空状态下使冰晶升华, 最后达到干燥。冻干法由于利用低温、 干燥、 隔氧的原理保藏菌种, 使菌种的代谢终止并处于休眠状态, 保藏期得以延长。20世纪50年代以来, 冻干法被广泛应用于微生物菌种的保藏, 研究表明: 除了某些不产孢子的丝状真菌(如食用菌中的某些担子菌)不宜采用此法保藏外, 其它各类微生物采用该法保藏均取得良好效果, 菌种保藏期可达lO年以上。另外, 冻干菌种便于保藏、 运输和商品化生产, 因而, 随着冻干技术和设备的日益完善, 冻干法已成为当前世界各国保藏微生物菌种的主要手段。冻干法保藏菌种的主要设备是真空冷冻干燥机, 型号各异。二、 影响茵种存活及长期保藏的主要因素(一)培养条件和菌龄实践证明: 保藏各类食品微生物菌种, 采用最适培养基和最适培养温度进行培养, 可提高微生物的存活率, 延长菌种保藏期; 同一菌种相同成分的培养基, 液体培养或固体培养对微生物的存活力影响不大。研究表明: 处于稳定期的细胞或成熟的孢子对不良环境具有较强的抗性, 因而, 保藏非芽孢细菌、 酵母菌, 应采用对数末期或稳定初期的细胞; 而保藏芽孢细菌、 放线菌、 霉菌, 要用成熟的孢子。(二)菌种悬液的浓度为了保证菌种保藏期间具有一定数量的存活细胞, 往往将保藏微生物的细胞浓度增大。一般要求: 细菌细胞和放线菌孢子的浓度 l0 cfumL; 酵母菌细胞和霉菌孢子的浓度10 cfumL。另外, 在液氮超低温冷冻、 真空干燥和真空冷冻干燥过程中, 高浓度细胞可降低每个细胞暴露在介质中的面积, 从而增强了抗冷冻、 抗干燥的能力, 提高了细胞存活率。(三)保护剂采用液氮超低温冷冻、 真空干燥和真空冷冻干燥保藏菌种, 保护剂的选择是提高微生物冷冻或干燥存活率、 延长菌种保藏期的关键因素。有人提出: 保护剂可分为低分子保护剂(如低聚糖类、 醇类、 缓冲盐类、 氨基酸和维生素类)和大分子保护剂(如蛋白质和多肽类、 多糖类)。作为低分子保护剂应具有很强的亲水性, 其结构应具备3个以上氢键, 对糖、 醇而言, 应具有5个以上的羟基, 在冷冻或干燥过程中, 可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键, 保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。而大分子保护剂经过”包裹”形式保护菌体, 同时, 促进低分子保护剂发挥作用。然而, 不同的食品微生物菌种所适宜的保护剂也不同, 必须经过试验精心筛选而确定, 不可照抄照搬。(四)冻结速度在液氮法和冻干法保藏菌种的过程中, 冻结速度是影响微生物存活率的重要因素。不同种类的食品微生物菌种所需要的冻结速度不同, 冻结速度必须与微生物细胞对水分的渗透率相平衡, 而细胞对水分的渗透率取决于细胞表面积与体积的比率以及细胞膜的渗透率。若冻结速度过慢, 胞内盐浓度升高造成细胞损伤; 若冻结速度过快, 胞内冰晶形成而损害细胞。实验表明: 细胞悬液以lmin的速度降温至一35 一40I h左右达到冻结视为适宜的慢速冻结; 而细胞悬液以l0 min以上的速度降温至一35 一40 短时间内达到冻结视为快速冻结。研究发现: 真核微生物菌种适宜慢速冻结; 而原核微生物菌种经慢速冻结和快速冻结后, 细胞存活率差异并不显著。(五)干燥程度水活度是影响干燥菌种保藏稳定性的重要因素。研究表明: 干燥菌种的水活度保持在01或含水量保持在15 30为宜。如果含水量30 , 菌种贮藏稳定性降低; 而含水量05 , 干燥后的细胞死亡率提高。(六)保藏条件根据菌种保藏的目的和原理, 尽量采取低温、 干燥、 避光、 真空密封等综合技术措施和条件保藏菌种, 以利于菌种保藏期的延长。(七)恢复培养处于液氮冷冻状态的菌种恢复培养时, 一般采用38124012快速升温解冻, 这是因为慢速升温解冻有可能使胞内再结冰, 造成胞内冰晶增大而伤害细胞。对于真空干燥和冻干菌种恢复培养时, 复水介质产生的渗透压和复水条件(温度、 pH)都有可能影响细胞膜以及酶蛋白分子的结构和性质发生变化, 造成细胞损伤活死亡。参考文献: 田洪涛, 贾英民, 河北农业大学学报(农林教育版) , 食品微生物学实验教学菌种的保藏, 6月第5卷第2期, P34-38附: 常见培养基配方1 营养琼脂培养基成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 1520g蒸馏水 1000ml制法: 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内, 加入15%氢氧化钠溶液约2ml, 校正pH7.27.4, 加入琼脂, 加热煮沸, 使琼脂溶化。分装在三角锥瓶中, 在121下高压灭菌15分钟。 2 乳糖胆盐发酵管培养基( 单料) 成分蛋白胨 20g猪胆盐 5g乳糖 10g0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL蒸馏水 1000ml pH7.4 制法将蛋白胨, 胆盐及乳糖溶于水中, 校正pH值, 加入指示剂分装, 每支管10ml, 并放入一个小倒管( 产气管) , 在115下高压灭菌15分钟。注: 双料乳糖胆盐发酵管培养基除蒸馏水外, 其它成分加倍。3 乳糖发酵管培养基( 单料) 成分蛋白胨 20g乳糖 10g0.04%溴甲酚紫水溶液 25ml 蒸馏水 1000mlpH7.4制法将蛋白胨及乳糖溶于水中, 校正pH, 加入指示剂分装, 每支管3ml, 并放入一个小倒管( 产生气) , 在115下高压灭菌15分钟。注: 双料乳糖发酵管培养基除蒸馏水外, 其它成分加倍。4 伊红美琼脂( EMB) 培养基成分蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 2g2%伊红溶液 20ml0.65%美兰溶液 10 ml蒸馏水 1000mlpH7.1制法将蛋白胨, 磷酸