大肠杆菌PCR检测方法.doc

大肠杆菌PCR检测方法

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2020年4月19日
文档仅供参考
ICS11.220
B41

DB21
辽宁省地方标准
DB 21/ XXXXX—XXXX

大肠杆菌PCR检测方法
Method of PCR for the detection of Escherichia coli
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XXXX - XX - XX发布
XXXX - XX - XX实施
辽宁省质量技术监督局发布

前言
本标准按照GB/T 1.1— 给出的规则起草。
本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。
本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。
本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。
本标准主要起草人：赵凤菊，关淼，关乃鹏，李清竹，陈瑶

大肠杆菌PCR检测方法
1　 范围
本标准规定了大肠杆菌PCR检测方法的技术要求。
本标准适用于大肠杆菌的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪粪便、脏器及纯培养物中大肠杆菌的检测。
本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。
2　 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范

3　 缩略语
下列缩略语适用于本标准。
E.coli：大肠杆菌（Escherichia coli）
DNA：脱氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate）
bp：碱基对（base pair）
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate）
Taq酶：Ex Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）
TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Tris acetate-EDTA buffer）
4　 原理
根据E.coli保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，经过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。
5　 仪器和器材
本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000g以上）、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管和0.2mL离心管、微量移液器和吸头等。
6　 试剂和材料
6.1　 DNAzol® Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4～8℃保存。
6.2　 无水乙醇：-20℃预冷。
6.3　 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。
6.4　 DNA聚合酶：Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）。
6.5　 dNTP(2.5 mmol/L)。
6.6　 引物：引物浓度为20μmol/L；上游引物序列为5’- GCCTCGCCTGGAGAATGA-3’， 下游引物序列为5’-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3’。
6.7　 阴性对照：灭菌双蒸水
6.8　 阳性对照：E.coli ATCC25922。
6.9　 无菌生理盐水。
6.10　 TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液，
6.11　 溴化乙锭。
6.12　 DL DNA Marker。
注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无菌的容器分装。
7　 操作步骤
7.1　 样品的采集、前处理、存放与运输
7.1.1　 采样注意事项
采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。
7.1.2　 采样工具
药匙、15 mL离心管和1.5 mL离心管经121（士2）℃均高压灭菌20 min；剪刀、镊子经160 ℃干热灭菌2 h。
7.1.3　 内脏样品的采集与前处理
采取病死或剖杀猪主要脏器（肝脏、脾脏、肺脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。
称取1 g 病料进行研磨，然后加入1mL无菌生理盐水，混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用。
7.1.4　 内容物的采集与前处理
采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15 mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000 rpm离心20min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用。
7.1.5　 粪便的采集与前处理
用药匙无菌采取发病猪新鲜粪便，装入15 mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用。
7.1.6　 血液
无菌采集心血，按1：1倍体积加入无菌生理盐水，混匀，转入1.5 mL灭菌离心管中编号备用。
7.1.7　 大肠杆菌纯培养物
挑取37℃ 18～24h培养的典型菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转入1.5 mL灭菌离心管中编号备用，待检。
7.1.8　 保存与运输
采集或处理的样品在2～8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免重复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6～8 h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。
7.2　 PCR检测
7.2.1　 DNA提取
7.2.1.1　 取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。
7.2.1.2　 每管加入800μL DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各200 μL，颠倒混匀后，4 ℃ 1 g离心10 min。
7.2.1.3　 取与7.2.1.1中相同数量灭菌的1.5 mL离心管，吸取900 μL上清液转移至相应的管中，加入500μL无水乙醇混匀后。
7.2.1.4　 4℃ 1 g离心5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL 75%乙醇，洗涤。
7.2.1.5　 4 ℃ 1 g离心5 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗2次。
7.2.1.6　 4000 g离心10 s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3～10 min。
7.2.1.7　 加入20 μL经高压处理的水，轻柔混匀，溶解管壁上的DNA，冰上保存备用；若需长期保存应放置-70 ℃冰箱。
7.2.2　 PCR
7.2.2.1　 PCR反应体系
建立25μL反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：
灭菌蒸馏水 17.375μL
10×PCR Buffer 2.5μL
2.5mM dNTP 2μL
Ex Taq DNA聚合酶 0.125μL
上游特异性PCR引物 0.5μL
下游特异性PCR引物 0.5μL
DNA 2μL
7.2.2.2　 PCR反应条件
94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min
7.2.2.3　 电泳
将PCR扩增产物6μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1 %琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL DNA Marker（分子质量标准物），缓冲液为1×TAE，以5 V/cm电压电泳25min。
8　 结果判定
紫外凝胶成像仪下观察结果，当阳性对照出现在272 bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果可作为判定依据。被检样品出现272 bp扩增条带为E.coli 核酸阳性，未出现272bp扩增条带的样品判为E.coli 核酸阴性。
A
A
附　录　A
（规范性附录）
试剂配制
A.1　 电泳缓冲液（50倍）
A.1.1 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）
二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯） 18.61 g
灭菌双蒸水 80 mL
氢氧化钠 调pH至8.0
灭菌双蒸水 加至100 mL
A.1.2 TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50倍)
羟基甲基氨基甲烷(Tris)（分析纯) 242 g
冰乙酸 57.1 mL
0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8. 0) 100 mL
灭菌双蒸水 加至1000 mL
用时用灭菌双蒸水稀释使用。
A.2　 1%琼脂糖凝胶
琼脂糖（电泳级） 1g
TAE电泳缓冲液(50倍) 2 mL
灭菌双蒸水 98 mL
微波炉中完全融化，加溴化乙锭(EB)溶液10 μL。
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