分子生物学基因工程与基因体外表达.pptx

全国高等医药教材建设研究会全国高等医药教材建设研究会卫生部规划教材卫生部规划教材全国高等学校教材全国高等学校教材 供七、八年制临床医学等专业用供七、八年制临床医学等专业用医学分子生物学医学分子生物学Medical Molecular Biology主编主编 冯作化冯作化人民卫生出版社人民卫生出版社 2005年年8月第一版月第一版课件制作：吴耀生课件制作：吴耀生(版权所有版权所有)广西医科大学基础医学院广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室 2008.10第十三章第十三章基因工程与基因体外表达基因工程与基因体外表达Gene Engineering and Gene Expression目的与意义目的与意义1.获得感兴趣的目的基因获得感兴趣的目的基因2.研究基因结构特征研究基因结构特征3.表达基因产物表达基因产物4.研究基因功能研究基因功能基本要素基本要素1.目的基因目的基因(target genes)2.工具酶工具酶(tool enzymes)3.载体载体(vectors)4.宿主细胞宿主细胞(host cells)Main contents 工具酶工具酶DNA载体载体基因克隆过程基因克隆过程真核细胞基因转染真核细胞基因转染基因改造基因改造克隆基因表达克隆基因表达电子克隆电子克隆基本概念及背景基本概念及背景For Example 如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(FPS)?1.查资料认识查资料认识FPS2.设计实验方案设计实验方案3.可行性分析可行性分析For Example FPS 克隆：克隆：RT-PCR，3-RACE，5-RACE改进的异硫氰酸胍一步法提取三七根部总改进的异硫氰酸胍一步法提取三七根部总RNART-PCR扩增扩增fps部分保守序列部分保守序列3-RACE 及克隆测序及克隆测序5-RACE 及克隆测序及克隆测序序列拼接序列拼接mRNA:5 AAAAAA3TTTTTTT-接头cDNA:Oligo dT接头接头基因特异性引物基因特异性引物3 Full RACE原理图原理图5 Full RACE原理图原理图(1)P5-端磷酸化端磷酸化RT-Primer未知区域未知区域已知序列已知序列Target mRNAAAAAAAAA-5 AAAAAAAA-5 P未知区域未知区域逆转录逆转录RNA分解分解P未知区域未知区域未知区域未知区域S1A1S2A21st PCR primers2nd PCR primers用用RNA ligase进行环化或形成首尾连接物进行环化或形成首尾连接物未知区域未知区域1stand 2nd PCR5-端磷酸化端磷酸化RT primer部位部位包含未知的包含未知的5上游区域的扩增产物上游区域的扩增产物(2)(3)(4)Thank YouDNA重组重组 DNA recombinationSome concerned concepts:DNA重组技术重组技术 DNA recombination technique分子克隆分子克隆 Molecular cloning基因工程基因工程 Genetic engineering克隆克隆 Cloning 三大理论基础三大理论基础1953年，年，Watson 和和Crick揭示了揭示了DNA分子的双螺分子的双螺旋结构模型和半保留复制原理，解决了基因的自旋结构模型和半保留复制原理，解决了基因的自我复制和传递的过程。我复制和传递的过程。40年代，年代，O.T.Avery等通过肺炎链球菌转化实验等通过肺炎链球菌转化实验发现遗传物质的携带者是发现遗传物质的携带者是DNA而不是蛋白质而不是蛋白质50年代末到年代末到60年代初，相继提出了年代初，相继提出了“中心法则中心法则”和操纵子学说，成功破译了遗传密码，阐明了遗和操纵子学说，成功破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流向和表达问题。传信息的流向和表达问题。三大技术发明三大技术发明 DNA分子的体外切割与连接技术分子的体外切割与连接技术 1970年年 Smith,Wilcox 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌(Haemopbilus influenzae)Hind II 1972年年 Boyer EcoR I “GAATTC”1967年年 世界上世界上5个实验室几乎同时发现了个实验室几乎同时发现了DNA ligase 1970年年 T4 DNA ligase大肠杆菌转化体系的建立大肠杆菌转化体系的建立-复制工厂复制工厂基因工程载体的使用基因工程载体的使用：plasmid,phage,viruses1978年年Nobel 医学与生理学奖医学与生理学奖The Nobel Prize in Medicine was awarded,in 1978,to Daniel Nathans,Werner Arber,and Hamilton Smith for the discovery of restriction endonucleases.Their discovery lead to the development of recombinant DNA technology that allowed,for example,the large scale production of human insulin for diabetics using E.coli bacteria.Over 3000 restriction enzymes have been studied in detail,and more than 600 of these are available commercially and are routinely used for DNA modification and manipulation in laboratories.DNA ligase repairing chromosomal damage.ligase I,DNA,ATP-dependent第一节第一节 基因克隆是利用工具酶进行操作基因克隆是利用工具酶进行操作v工具酶工具酶(Tool enzymes)-用于对用于对DNA分子进行定点切割、连接、扩增、分子进行定点切割、连接、扩增、标记等操作的特殊酶类，已被纯化并商品化进标记等操作的特殊酶类，已被纯化并商品化进行应用行应用一、一、限制酶限制酶(RE,restriction endonuclease)二、其他工具酶二、其他工具酶(other tool enzymes)一、一、RE在基因克隆中用于切割在基因克隆中用于切割DNAvRE(restriction enzyme,restriction endonuclease)-限制性核酸内切酶，限制酶，限制性核酸内切酶，限制酶，能识别能识别DNA双链内特异位点并水解磷酸二酯键，双链内特异位点并水解磷酸二酯键，产生特定末端的酶产生特定末端的酶Restriction enzyme Functions:能识别能识别DNA内部特异位点并且裂解磷酸二酯键内部特异位点并且裂解磷酸二酯键(1)Sorting of restriction enzyme有三型，但最重要的是有三型，但最重要的是II型酶型酶(2)Naming of RE 细细菌菌属属名名细细菌菌种种名名细细菌菌菌菌株株编编号号Escherichia coli RY13 I属属Genus,种种-species,菌株菌株-strainEcoR ITwo catalytic manganese ions(one from each monomer)are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme(depicted as gaps in the DNA backbone).Structure of the homodimeric restriction enzyme EcoRI(cyan and green cartoon diagram)bound to double stranded DNA(brown tubes)based on the PDB 1QPS X-ray crystallographic coordinates.(3)限制酶的识别和切割位点限制酶的识别和切割位点Characters:通常通常识别识别46个碱基个碱基，少数识别，少数识别8个个所识别的序列一般为所识别的序列一般为回文结构回文结构(palindrome)在特异位点内切割在特异位点内切割DNA双链，产生双链，产生两种两种末端末端 粘性末端粘性末端平端平端5-粘性末端粘性末端3-粘性末端粘性末端5-CCCGGG-33-GGGCCC55-CCC GGG-33-GGG CCC-5+平端切割平端切割(blunt end,such as Sma I)Go to 1095-GGTGAATTCAGC-33-CCACTTAAGTCG55-TTGCTGCAGAAG-33-AACGACGTCTTC55-粘性末端粘性末端(EcoR I)3-粘性末端粘性末端(Pst I)5-GGTG AATTCAGC-33-CCACTTAA GTCG5+5-TTGCTGCA GAAG-33-AACG ACGTCTTC5+(4)同工异源酶同工异源酶(isoschizomers)来源不同，但能识别和切割同一位点的来源不同，但能识别和切割同一位点的RE 例：例：Bam H I&Bst I(GGATCC)Xho I&Pae R7(CTCGAG)(5)同尾酶同尾酶(isoaudamers)识别序列不同，但产生相同粘性末端的识别序列不同，但产生相同粘性末端的RE 例：例：Bam H I(GGATCC)Sau 3A I(NGATCN)RE作用的条件：作用的条件：一定的盐溶度；一定的盐溶度；Mg2+;不需不需ATPRE识别序列长度与切点数：识别序列长度与切点数：对同一对同一DNA，识别序列短的，切点数多，片段，识别序列短的，切点数多，片段较短；反之则反之较短；反之则反之二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶v其他工具酶其他工具酶-用于对用于对DNA分子进行多种操作，分子进行多种操作，也叫也叫修饰酶修饰酶作用：作用：剪切、补平、连接、化学修饰等剪切、补平、连接、化学修饰等常用：常用：(1)DNA polymerase I，Klenow Fragment(2)Reverse transcriptase(3)T4 DNA ligase(4)Alkaline phosphatase(5)Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT(6)Taq DNA polymeraseSo on(1)DNA polymerase IActivities：53聚合活性，聚合活性，53及及 35外切活性外切活性Functions：在生物体内，填补引物切除后留下的空缺，修复在生物体内，填补引物切除后留下的空缺，修复在生物体外，缺口平移制备探针在生物体外，缺口平移制备探针DNA polymerase IKlenow fragment(76KD)Another small fragment 枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶Klenow片段片段35kD76kDNCE.coli DNA pol I53外切酶外切酶53聚合聚合酶酶35外切外切酶酶用枯草杆菌蛋白酶裂解全酶用枯草杆菌蛋白酶裂解全酶53聚合聚合酶酶35外切外切酶酶76kDCKlenow fragment 用途：用途：1)补齐双链补齐双链DNA的的3-末端末端2)通过补齐通过补齐3端使端使3端标记端标记3)在在cDNA克隆中，第二股链的合成克隆中，第二股链的合成4)DNA序列分析序列分析常用的常用的reverse transcriptase:禽类成骨细胞性白血病病毒禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶逆转录酶(2)Reverse transcriptase用途：用途：合成合成cDNA，构建，构建cDNA文库文库Moloney 小鼠白血病病毒小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶逆转录酶第二节第二节 基因克隆需要特定的基因克隆需要特定的DNA载体载体基因克隆为什么需要载体？基因克隆为什么需要载体？载体的类型载体的类型-克隆载体，表达载体克隆载体，表达载体载体的来源载体的来源细菌质粒细菌质粒噬菌体噬菌体DNA(DNA,M13 DNA)病毒病毒DNA人工载体人工载体(cosmid)等等vDNA载体载体(vector)-能与能与DNA片段连接，构建片段连接，构建成新的重组成新的重组DNA分子，并可携带该外源分子，并可携带该外源DNA片片段进入一定宿主细胞，在宿主中扩增甚至表达，段进入一定宿主细胞，在宿主中扩增甚至表达，并有遗传标记进行筛选并有遗传标记进行筛选载体的概念载体的概念Cloning vector能够携带感兴趣的外源能够携带感兴趣的外源DNA（target DNA）进入宿主细胞，并将外源）进入宿主细胞，并将外源DNA在宿主内进行克隆和扩增，而采用的一些在宿主内进行克隆和扩增，而采用的一些DNA分子称为分子称为Cloning vector。Cloning vector classes Plasmid DNA(质粒质粒DNA)Phage DNA (噬菌体噬菌体DNA)Virus DNA(病毒病毒DNA)Expression vector 能使外源基因在宿主中能使外源基因在宿主中表达的载体表达的载体Expression vector:含表达调控有关的元件含表达调控有关的元件When E coli is used as host cell,plasmid,phage,cosmid,M13 phage can usually be used as vectors载体的本质是什么？载体的本质是什么？Vector characters(cloning vector):能在宿主细胞中自我复制、自我表达能在宿主细胞中自我复制、自我表达分子相对较小，在宿主细胞中有高拷贝分子相对较小，在宿主细胞中有高拷贝具有遗传标志具有遗传标志有多个限制性酶单一酶切位点有多个限制性酶单一酶切位点(多克隆位点多克隆位点)易与宿主易与宿主DNA相分离相分离一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒v(一一)质粒是常用的克隆载体质粒是常用的克隆载体Examples:pBR322pUC Characters:a.Small molecular weight,high copiesb.More than one genetic markc.Multiple cloning sites,MCSpBR322Turn to 64pUC19 v(二二)噬菌体经过重组也可以携带外源噬菌体经过重组也可以携带外源 DNAExamples:bacteriophage,phage;M13 phageIt is a kind of virus which can infect bacteria bacteriophages in common use:EMBL spectrum gt spectrumCharon spectrum bacteriophage,phage 噬菌体是侵犯细菌的病毒。在菌体内为环噬菌体是侵犯细菌的病毒。在菌体内为环状状DNADNA分子；分离产物为双链线状分子；分离产物为双链线状DNADNA分子，有天分子，有天然的粘性末端（称然的粘性末端（称COSCOS位点），进入宿主菌后可位点），进入宿主菌后可自行环合。基因组自行环合。基因组DNADNA长约为长约为48.5Kb48.5Kb,共有共有6666个基个基因，较复杂。因，较复杂。Character：1 1、其生长必需的序列位于左右二臂其生长必需的序列位于左右二臂上，中部约上，中部约30%30%为生长非必需；为生长非必需；2 2、成熟需要包装成熟需要包装（大小为原来的（大小为原来的75-105%75-105%时）时）Two kinds of vectors：置换型载体；插入型载体置换型载体；插入型载体置换型置换型噬菌体载体：噬菌体载体：用限制酶切除中央片段用限制酶切除中央片段供目的基因替代，目的基因与左、右载体两臂供目的基因替代，目的基因与左、右载体两臂结合。结合。替代片段可达替代片段可达9 923Kb23Kb。左臂左臂中央片段中央片段右臂右臂酶切点酶切点酶切点酶切点切除后用目的基因取代切除后用目的基因取代COS位点位点COS位点（位点（12bp)The life period of phage(噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期):Lysogenic pathway(溶原生长途径溶原生长途径)Lysis pathway(溶菌生长途径溶菌生长途径)溶原生长溶原生长溶菌生长溶菌生长溶原转溶菌生长溶原转溶菌生长以噬菌体为媒介的转导作用以噬菌体为媒介的转导作用 gt10:insertion vector;multiple cloning site:CIThe positive marks of screening:Whether the recombinant vector can be wrapped(If no extraneous DNA replaced,the vector would be too small to be wrapped)With insertion,CI activity lost,to be transparent spots;Without insertion,CI keeps intact,to be turbid spots gt11：insertion vector;MCS:lac Z；expressedWith insertion into lac z of gt11,white spotsOtherwise blue spots v(四四)粘性质粒适合克隆较大的粘性质粒适合克隆较大的DNA片段片段粘性质粒粘性质粒(cosmid)由由DNA的的cos区与质粒重新构建的载体，具有区与质粒重新构建的载体，具有与质粒相同的结构特点，为双链环状与质粒相同的结构特点，为双链环状DNA。It is constructed with the cos region of DNA and plasmid,which is double cycle DNA with bigger content for cloning(4050kb)Characters:1)With antibiotics marks and replication element itself2)With cos region of phage,can be wrapped3)With one or more cloning sites4)Small molecular weight5)non-recombination cosmid too small to be wrapped,so it is screened easilyv(三三)M13噬菌体适合制备单链噬菌体适合制备单链DNAM13 bacteriophage:It is a kind of E coli phage,the genome6.5kb,a cycle DNA containing singlestrand DNATwo forms:Wild form;Replication form(RF)The most merit:Can be released from host as single strandM13 phage Characters:In vivo,double strands DNA(can be replicated)In vitro,single strand DNA(can be used as template for DNA sequencing,or make DNA probes for hybridization)After entering host cells,it is replicated to double strands DNA and becomes replicational form DNA(RF DNA)which can be used as cloning vectorv(五五)病毒载体可将外源病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞带入哺乳动物细胞Virus vectors in common use:逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，EB病毒病毒等病毒载体，可将外源基因导入受体细胞等病毒载体，可将外源基因导入受体细胞Characters:多数均已质粒化，由病毒启动子、包装元件、选多数均已质粒化，由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记及择性遗传标记及pBR322复制起始点组成复制起始点组成Other vectors:YAC,yeast artificial chromosome(0.52Mb)BAC,bacterial artificial chromosome(0.4Mb)二、表达载体将外源基因带入宿主并表达二、表达载体将外源基因带入宿主并表达vExpression vectors Concept:The conditions for expression vector:With expression structures except for the characters of cloning vectorsThe vectors which can make the extraneous DNA be expressed in host cells are termed as expression vectors.Sorts:Expression vectors of E coli(prokaryote)Expression vectors of eukaryoteExpression vectors of mammal animals v(一一)原核表达载体适于原核细胞表达外源基因原核表达载体适于原核细胞表达外源基因Expression vectors of E coli:除克隆所需成分外，还含有启动子，核糖体除克隆所需成分外，还含有启动子，核糖体结合位点，转录终止序列等表达元件结合位点，转录终止序列等表达元件Trp-lac promoter(or tac promoter)Inducer:IPTGStrains:RB791,XL-1-blue,SB221,JM 1091.PromoterT7 of T7 phage It is a high effective expression promoterStrain:JM109(DE3)PL of-phage(temperature induce promoter)Controlled by cIts857(sensitive to temperature),clts857为温度敏感阻抑物为温度敏感阻抑物Strain:M5219原核生物原核生物mRNA与核蛋白体小亚基结合的分子机制与核蛋白体小亚基结合的分子机制AUU C C UCCACUAGG核蛋白体小亚基的核蛋白体小亚基的16S-rRNA5A G G A PuPuUUUPuPuAUG3mRNARps辨认序列辨认序列SD序列序列Ribosome-binding site,RBS Including AUG,SD sequence 2.核糖体结合位点核糖体结合位点(RBS)作用：作用：3.转录终止序列转录终止序列保证外源基因在宿主中的高效表达保证外源基因在宿主中的高效表达使读码框架能够正确转录使读码框架能够正确转录v(二二)真核表达载体适于真核细胞表达外源基因真核表达载体适于真核细胞表达外源基因Eukaryote expression vectors:含有一定的原核序列：含有一定的原核序列：E coli中的中的ori位点；位点；antibacterial site含有一定的真核序列：含有一定的真核序列：真核细胞中的药物抗性基因；真核表达组件，如真核细胞中的药物抗性基因；真核表达组件，如真核复制起点，启动子真核复制起点，启动子/增强子，克隆位点，加增强子，克隆位点，加尾信号等尾信号等 Expression vectors of mammal animalIf a gene needs to be expressed in mammal animal cells,the eukaryote expression vector must be used.The essential elements including:Replica origin,antibiotics sites,eukaryote promoter,enhancer,cloning sites,termination signal,poly A signal第三节第三节 基因克隆过程包括五个基本部分基因克隆过程包括五个基本部分vGene cloning process(1)制备目的基因及相关载体制备目的基因及相关载体(2)将目的基因与载体进行连接将目的基因与载体进行连接(3)将重组将重组DNA导入受体细胞导入受体细胞(4)DNA重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定(5)DNA重组体扩增、表达及其他研究重组体扩增、表达及其他研究分分切切接接筛筛转转一、采用不同方法获取目的基因一、采用不同方法获取目的基因vMethods to get a target gene:(1)To prepare genomic library(2)To prepare cDNA library or cDNA(3)To PCR(4)To synthesize the DNA fragment by chemical methodv(一一)从基因组文库中获得目的基因从基因组文库中获得目的基因Genomic library:指含有一个机体基因组指含有一个机体基因组DNA的全套重组的全套重组DNA分分子的克隆群体子的克隆群体用于构建基因组文库的载体：用于构建基因组文库的载体：-噬菌体噬菌体(-phage)，粘性质粒，粘性质粒(cosmid)Genomic library construction:分离高分子量分离高分子量DNA分离回收分离回收1525 kb的的DNA片段片段部分消化，以切成一定大小片段部分消化，以切成一定大小片段回收片段与适当载体连接回收片段与适当载体连接所有重组所有重组DNA分子转入宿主细胞并扩增分子转入宿主细胞并扩增基因组文库基因组文库随机文库克隆数目计算随机文库克隆数目计算随机文库指代表基因组各部分随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等。对的摩尔数相等。对于随机文库，有：于随机文库，有：ln(1-P)N=ln(1-)xyN:克隆数目克隆数目P:设定的概率值设定的概率值(如：如：0.99)x:插入片段平均大小插入片段平均大小(1520kb)y:植物基因组大小植物基因组大小(以以kb计计)如果插入片段平均大小为如果插入片段平均大小为20kb，某植物基因组大小，某植物基因组大小为为4x108bp，P=0.99时，根据上式，时，根据上式，N1X101X105 5。含。含1X101X105 5个克隆的基因文库相当覆盖了个克隆的基因文库相当覆盖了5 5倍的基因组，在倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于于0.990.99。植物基因组大小植物基因组大小 及克隆文库所需噬菌斑数及克隆文库所需噬菌斑数植物种类植物种类 基因组大小基因组大小(bp)(bp)a a 重组噬菌斑数重组噬菌斑数b b拟南芥拟南芥 7.7X107.7X107 7 2.1X10 2.1X104 4大豆大豆 8.7X108.7X108 8 2.4X10 2.4X105 5菜豆菜豆 1.8X101.8X109 9 4.9X10 4.9X105 5碧东茄碧东茄 1.9X101.9X109 9 5.1X10 5.1X105 5烟草烟草 3.8X103.8X109 9 1.0X10 1.0X106 6玉米玉米 3.9X103.9X109 9 1.1X10 1.1X106 6小麦小麦 1.5X101.5X101010 4.1X10 4.1X106 6a a，基因组大小引自，基因组大小引自RogersRogers和和Bendich;b.Bendich;b.假设插入片段为假设插入片段为17kb,17kb,概率为概率为0.990.99。v(二二)从从cDNA文库中获得目的基因文库中获得目的基因cDNA library:指含有一个机体某种特定细胞或特定状态下表达指含有一个机体某种特定细胞或特定状态下表达基因的全部基因的全部cDNA 克隆的群体克隆的群体cDNA library characters:不含内含子，用不含内含子，用mRNA经逆转录构建经逆转录构建cDNA library vectors:-gt10;-gt11;Ziplox et alcDNA library construction:分离分离mRNARNase H水解去掉水解去掉mRNA以以oligo(dT)为引物，合成为引物，合成cDNA第一链第一链随机引物，随机引物，DNA pol I合成第二链合成第二链修齐两端，加人工接头，修齐两端，加人工接头，与载体连接，得到与载体连接，得到cDNA重组体，重组体，所有所有cDNA 重组体均转入宿主扩增重组体均转入宿主扩增cDNA 文库文库v(三三)利用利用PCR技术获得目的基因技术获得目的基因采用采用T载体载体(AT克隆克隆)：pGEM-T vector;pMD18-T Vector 合成长度有限合成长度有限可人工设计相应的序列，不必使用天然模板可人工设计相应的序列，不必使用天然模板v(四四)人工合成目的基因人工合成目的基因Plasmid phage cosmid M13 phageCapacity 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb of cloninggDNA library -+-cDNA library +-Subcloning +-+Sequencing +-+E coli expression +-二、依据基因克隆的目的选择和准备载体二、依据基因克隆的目的选择和准备载体vCloning vectors in common use:(1)The ligation by cohesive endsAdvantage:easily linked Disadvantage:easily to be cycled self bidirection insertion(2)The ligation with artificial linker(3)The ligation with homopolymeric tail(4)The ligation by blunt ends High ATP con.T4 DNA ligase should be used三、选择适当的策略将三、选择适当的策略将DNA片段进行连接片段进行连接vMethods in common use:(一一)粘性末端的连接粘性末端的连接全同源粘性末端全同源粘性末端 最方便，但载体自身环化，并为双最方便，但载体自身环化，并为双向插入向插入5G3CTTAAppAATTC3G5GCTTAAppAATTCG5G3CTTAAppAATTC3G5例：用例：用EcoR I分别切割载体和目的分别切割载体和目的DNA：切割载体：切割载体：切割目的切割目的DNA：GCTTAAAATTCGAATTC3G55G3CTTAA双向插入示意图：双向插入示意图：GCTTAAAATTCGAATTC3G55G3CTTAA粘粘性性末末端端的的连连接接(二二)用人工接头法克隆用人工接头法克隆cDNA连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶(三三)同聚物接尾法克隆双链同聚物接尾法克隆双链DNA转化适当的宿主转化适当的宿主退火退火载体载体(一一)转化转化(transformation)四、重组四、重组DNA需要导入宿主细胞进行扩增需要导入宿主细胞进行扩增vMethods in common use:(二二)感染感染(infection)(三三)转染转染(transfection)(四四)电穿孔电穿孔(electroporation)v(一一)转化是直接将转化是直接将DNA导入细菌的方法导入细菌的方法Transformation：指将质粒或其他外源指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。主菌，并使其获得新的表型的过程。宿主菌：宿主菌：E coli感受态细胞的制备：感受态细胞的制备：低温低温CaCl2处理，使细胞处理，使细胞通透性增加，易于摄取外源通透性增加，易于摄取外源DNA，这种细胞称，这种细胞称为感受态细胞为感受态细胞(competent cell)v(二二)感染是利用噬菌体将外源感染是利用噬菌体将外源DNA导入宿主导入宿主Infection：指指噬菌体、粘性质粒或真核细胞病毒为载体噬菌体、粘性质粒或真核细胞病毒为载体的重组的重组DNADNA分子，在体外经过包装成具有感染分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后感染适当宿主能力的病毒或噬菌体颗粒，然后感染适当宿主细胞的过程细胞的过程 用于包装的宿主菌：用于包装的宿主菌：琥珀突变株琥珀突变株Dam溶菌物：溶菌物：含头部蛋白含头部蛋白突变株突变株Eam溶菌物：溶菌物：含尾部蛋白含尾部蛋白Dam溶菌物溶菌物+Eam溶菌物溶菌物+DNA重重组体体包装噬菌体包装噬菌体重组有外源重组有外源DNA的逆转录病毒载体的逆转录病毒载体感染感染辅助病毒辅助病毒-2-2细胞细胞包装成病毒颗粒包装成病毒颗粒有感染能力有感染能力v(三三)转染是将外源转染是将外源DNA导入真核细胞的方法导入真核细胞的方法Transfection：指真核细胞主动摄取或被动导入外源指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段片段而获得新的表型的过程而获得新的表型的过程Methods：电穿孔电穿孔磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法脂质体融合法脂质体融合法进入细胞进入细胞的的DNA存存在方式在方式染色体外染色体外整合至宿主整合至宿主基因组中基因组中(一一)遗传学方法遗传学方法五、重组五、重组DNA导入宿主后筛选与鉴定导入宿主后筛选与鉴定vMethods in common use:(二二)免疫学方法免疫学方法-检测表达产物检测表达产物(三三)核酸杂交核酸杂交(四四)PCR技术技术抗性标记抗性标记表型标记表型标记插入失活插入失活互补互补(五五)酶切鉴定酶切鉴定Go to 23Go to 103Go to 104Go to 105第四节第四节 真核细胞基因转染真核细胞基因转染Transfection：指真核细胞主动摄取或被动导入外源指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段片段而获得新的表型的过程而获得新的表型的过程一、真核细胞转染的方法与基本原理一、真核细胞转染的方法与基本原理二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选(一一)磷酸钙共沉淀示介导基因转染磷酸钙共沉淀示介导基因转染一、真核细胞转染的方法与基本原理一、真核细胞转染的方法与基本原理vMethods in common use:(二二)电穿孔法介导基因转染电穿孔法介导基因转染(electroporation)(三三)DEAE-葡聚糖法介导基因转染葡聚糖法介导基因转染(DEAE-dextran)(四四)脂质体介导基因转染脂质体介导基因转染(liposome)(五五)显微注射法显微注射法(microinjection)Calcium phosphate co-precipitation (1