全自动加速溶剂萃取-高效液...定土壤中6种抗生素的残留量_潘晓春.pdf

：全自动加速溶剂萃取高效液相色谱串联质谱法测定土壤中种抗生素的残留量潘晓春（山东科泰环境监测有限公司，临沂 ）摘要：随机选取代表性土壤样品约，四分法将土壤样品缩分，取约 风干、粉碎、过筛。取上述土壤样品 置于萃取池中，加入硅藻土 混合均匀后进行加速溶剂萃取（），采用凝胶净化系统净化提取液。取净化液，于 氮吹至近干，残渣用甲醇溶解，过 滤膜，采用高效液相色谱串联质谱法（）测定其中林可霉素、克林霉素、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星等种抗生素的含量，质谱分析采用多反应监测模式。结果表明，种抗生素的质量浓度在 内与对应的峰面积呈线性关系，检出限（）为 。方法用于分析单标准溶液和加标样品溶液，所得测定值的相对标准偏差（）均小于。按标准加入法进行回收试验，回收率为 。方法用于实际样品分析，种抗生素的检出量为 。关键词：全自动加速溶剂萃取（）；土壤；抗生素；林可霉素；洛美沙星；高效液相色谱串联质谱法（）中图分类号：文献标志码：文章编号：（）目前我国使用和销售量最多的 种药物中，抗生素占 种，据统计我国住院病人联合使用抗生素率约，远超 的国际水平，而在美国等发达国家抗生素的使用率仅约。此外，抗生素在畜禽养殖过程中，常采用直接喂食、注射或作为饲料添加剂用于预防和治疗畜禽疾病。随着大量抗生素被摄入到人体或动物体，约 的抗生素以原药或代谢产物随粪便、尿液等排出体外，大部分被作成肥料用于农作物的种植，从而对土壤环境和人体健康造成巨大的潜在危害，如抗生素对土壤中的微生物生长代谢、生态平衡等造成影响，部分抗生素被农作物吸收后，通过食物链的传递作用，在人体内不断蓄积，会对人体产生一定的毒性作用，如引起过敏、再生障碍性贫血、耳聋等症状。林可霉素、克林霉素属于林可霉素类抗生素，洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星属于氟喹诺酮类抗生素，这几种抗生素在生活中较为常见，且使用范围较广。因此，加强对土壤中林可霉素、克林霉素、收稿日期：作者简介：潘晓春，高级工程师，从事环境检测工作，洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星的监控，具有重要的现实意义。关于土壤样品中林可霉素、克林霉素、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星的研究文献较少，主要集中在研究喹诺酮类抗生素残留上。而林可霉素类抗生素在畜禽养殖中使用较多，关于林可霉素类抗生素和氟喹诺酮类抗生素联合检测的报道却极少。本工作采用全自动加速溶剂萃取法（）提取土壤中残留的林可霉素、克林霉素、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星，以高效液相色谱串联质谱法（）测定其含量。试验部分仪器与试剂 型高效液相色谱仪；型三重四极杆质谱仪；型全自动加速溶剂萃取仪；型自动凝胶渗透色谱仪；型电子天平；型超纯水制备仪。单标准储备溶液：，移取林可霉素标准溶液，置于 棕色容量瓶中，加潘晓春：全自动加速溶剂萃取高效液相色谱串联质谱法测定土壤中种抗生素的残留量甲醇定容，摇匀。同法制备克林霉素、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星单标准储备溶液，于 避光储存，有效期。使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。混合标准溶液系列：取适量的单标准储备溶液，用甲醇逐级稀释，配制成质量浓度分别为 ，的混合标准溶液系列。林可霉素标准溶液（）、克林霉素标 准 溶 液（）、洛 美 沙 星 标 准 溶 液（）、培氟沙星标准溶液（）、恩诺沙星标准溶液（）、环丙沙星标准溶液（）的质量浓度均为 ；乙腈、甲醇均为色谱级；其他试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。仪器工作条件 条件萃取温度 ，萃取压力 ；加热时间 ；静置时间 ；循环次数次；冲洗体积为萃取池体积的；氮气吹扫时间 ；萃取溶剂为体积比:的甲醇乙腈混合液。色谱条件 色 谱 柱（，）；柱 温 ；流 量 ；进样体积；流动相 为（体积分数）甲酸溶液，为甲醇。梯度洗脱程序：时，为；时，由 升至；时，由 升至，保持 ；时，由 降至，保持 。质谱条件电喷雾离子（）源，正离子扫描模式，离子源温度 ，离子喷雾电压 ；气帘气压力 ，雾 化 气 压 力 ，碰 撞 气 压 力 ；多反应监测（）模式，其他质谱参数见表。表质谱参数 序号抗生素保留时间 质荷比（）分子离子定量离子定性离子去簇电压碰撞电压定量离子定性离子林可霉素 克林霉素 洛美沙星 培氟沙星 恩诺沙星 环丙沙星 试验方法随机选取代表性土壤样品（如医药园区及周边土壤、城郊种植土壤、城市绿化土壤等）约，四分法将土壤样品缩分，取约 自然风干，风干后的土壤样品粉碎，过孔径 （目）的筛网，如未过筛网则继续粉碎，直至所有土壤样品过筛。准确称取上述土壤样品，置全自动加速溶剂萃取仪萃取池中，加硅藻土，混合均匀后，按照节条件进行 操作。将萃取液置塑料离心管中，以转速 冷冻离心 ，离心后的溶液转移至凝胶净化系统，过 色谱柱，用体积比:的甲醇乙腈混合液以流量 进行净化洗脱，收集 的净化液。取净化液，在水浴温度 下氮吹至近干，残渣用甲醇溶解，过 滤膜，得到的样品溶液按照仪器工作条件进行测定。结果与讨论色谱行为按照仪器工作条件测定混合标准溶液，得到的色谱图见图。提取方法的选择通常情况下，土壤中抗生素残留量极低，因此选择合适的提取方法，对提高检测结果的准确度，切实体现土壤中抗生素含量的真实水平具有重要的作用。常用的提取方法有超声提取法、固液萃取法和 等 。使用超声提取法时，抗生素易分解，提取率较低、准确度较差；固液萃取法提取过程较为繁琐，提取率较低，且用到大量的有机溶剂，对试验潘晓春：全自动加速溶剂萃取高效液相色谱串联质谱法测定土壤中种抗生素的残留量峰号对应的抗生素同表图典型色谱图 环境造成影响；在密闭条件下，通过选用适合的萃取溶剂，在一定的温度和压力下，反复多次提取，提取率较好，且环境友好。试验分别选择上述种提 取 方 法 对 种 抗 生 素 质 量 浓 度 均 为 的土壤加标样品溶液进行提取，并考察了其对抗生素回收率的影响，结果也显示 的提取效果较好，具体数据见表。表提取方法对抗生素回收率的影响 抗生素回收率超声提取法固液萃取法 林可霉素 克林霉素 洛美沙星 培氟沙星 恩诺沙星 环丙沙星 净化方法的选择土壤基质中含有较多的硅酸盐、磷酸盐等无机物，以及植物和动物残留物等有机物，土壤样品经 提取后，提取液中含有较多的干扰成分，因此需要对提取液进行净化处理。常用的净化方法有液液萃取法、固相萃取法和凝胶净化色谱法等 。液液萃取法溶剂用量较大，且基质去除不够彻底，导致检测准确度和灵敏度较低；固相萃取法需要对固相萃取柱进行活化、富集、洗脱，操作步骤较为繁琐，且检测准确度偏低；凝胶净化色谱法的分离原理类似于液相色谱，该方法净化效果好，且处理过程中抗生素的损失量较低，因此检测准确度较高。试验分别选择上述种净化方法，对种抗生素质量浓度均为 的土壤加标样品溶液提取后进行净化，所得种抗生素的回收率见表。表净化方法对抗生素回收率的影响 抗生素回收率液液萃取法固相萃取法凝胶净化色谱法林可霉素 克林霉素 洛美沙星 培氟沙星 恩诺沙星 环丙沙星 由表可知，凝胶净化色谱法具有较佳的净化效果，种抗生素的回收率均较高。因此，试验选择凝胶净化色谱法进行净化。凝胶净化色谱柱的选择凝胶净化色谱系统常用的净化色谱柱有 柱（填料为聚苯乙烯凝胶）和 柱（填料为葡聚糖凝胶）。试验分别选择上述种凝胶净化色谱柱，对种抗生素质量浓度均为 的土壤加标样品溶液提取后进行净化，所得种抗生素的回收率见表。表凝胶净化色谱柱对抗生素回收率的影响 抗生素回收率 柱 柱林可霉素 克林霉素 洛美沙星 培氟沙星 恩诺沙星 环丙沙星 由表可知：使用 柱时，种抗生素中仅恩诺沙星的回收率大于，其余均低于；而使用 柱时，种抗生素的回收率均大于，净化效果较好。因此，试 验 选 择 柱 作 为 凝 胶 净 化 色谱柱。质谱条件的优化分别取种抗生素的质量浓度均为 的单标准溶液，待质谱仪稳定后，设定采集模式潘晓春：全自动加速溶剂萃取高效液相色谱串联质谱法测定土壤中种抗生素的残留量为全扫描（）模式，分别找到待测抗生素分子离子；根据找到的待测抗生素分子离子，设定采集模式为产物离子扫描（）模式，找到各待测抗生素分子离子对应的碎片离子；选择响应较强的个碎片离子，其中个作为定量离子，另外个作为定性离子，再分别对选择的定性、定量离子进行碰撞电压和去簇电压的优化，优化的质谱条件见节。标准曲线、检出限和测定下限按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列，以抗生素的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，种抗生素的质量浓度在 内与对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表。以倍信噪比（）计算检出限（），以 倍信噪比计算测定下限（），结果见表。表线性参数、检出限和测定下限 ，抗生素线性回归方程相关系数检出限（）测定下限（）林可霉素.克林霉素.洛美沙星.培氟沙星 .恩诺沙星 .环丙沙星.精密度试验仪器精密度试验按照仪器工作条件测定 单标准溶液，连续进样次并采集谱图，计算峰面积的相对标准偏差（）。结果表明，林可霉素、克林霉素、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星峰面积的 分别为，和，表明仪器精密度良好。重复性试验取阴性土壤样品，按照试验方法处理并制备 的加标样品溶液，平行制备份，按照仪器工作条件测定，并计算测定值的 。结果表明，林可霉素、克林霉素、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星测定值的 分别为 ，和 ，表明方法重复性良好。回收试验取阴性土壤样品，按照试验方法处理并进行 ，等个浓度水平的加标回收试验，计算抗生素的回收率，结果见表。表回收试验结果 抗生素回收率加标量 加标量 加标量 林可霉素 克林霉素 洛美沙星 培氟沙星 恩诺沙星 环丙沙星 样品分析随机采集本地典型土壤样品（医药园区、园区周边、城郊耕地、城郊土壤、市区土壤），按照试验方法进行处理，每个样品平行制备份；按照仪器工作条件测定土壤中林可霉素、克林霉素、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星的含量，结果见表。表样品分析结果 抗生素测定值（）医药园区园区周边城郊耕地城郊土壤市区土壤林可霉素克林霉素 洛美沙星 培氟沙星恩诺沙星 环丙沙星 本工作采用全自动 提取土壤中的林可霉素、克林霉素、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星等种常见抗生素，以凝胶净化系统净化提取液，净化后的提取液经浓缩后，以 测定其含量。结果表明，方法快速、简便、准确，适用于土壤中微量抗生素残留的监测。潘晓春：全自动加速溶剂萃取高效液相色谱串联质谱法测定土壤中种抗生素的残留量参考文献：杨立顺，李东霞，耿婕 我国抗生素滥用研究现状与热点 基于科学知识图谱的可视化分析 甘肃科技，（）：杨波，曹秀菁 儿童抗生素滥用现状研究进展 齐齐哈尔医学院学报，（）：周建民 浅析兽用抗生素使用现状及应对措施 河南畜牧兽医，（）：杨晓伟畜禽产品抗生素残留的危害及控制中国动物保健，（）：朱玥晗，姚钦，李森，等环境中抗生素抗性基因及消减途径研究 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