急性分离大鼠心室肌细胞的Ca2-电流和细胞内Ca2-浓度.docx

急性分离大鼠心室肌细胞的Ca2+电流和细胞内Ca2+浓度
【摘要】 目的在急性分离SD大鼠心室肌细胞上,检测Ca2+电流(ICa)和Ca2+浓度“[Ca2+“]i的变化。方法改良Langendroff法,用含胶原酶I(1750 U/mL)和蛋白酶ⅩⅣ( mg/mL)的无Ca2+台氏液经大鼠主动脉循环灌流法,急性分离大鼠心室肌细胞;采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的ICa,动态细胞荧光成像技术检测心室肌细胞“[Ca2+“]i的变化。结果在20 min内新鲜分离大鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术可记录电刺激引起心室肌细胞的ICa,1 μmol/L异丙肾上腺素可显着增加ICa;并观察到心室肌细胞“[Ca2+“]i以及电刺激增强“[Ca2+“]i的效应。结论大鼠心室肌细胞急性分离方法简便实用,所分离的心室肌细胞形态和功能正常,适用全细胞膜片钳和动态细胞荧光成像技术检测实验。
【关键词】 心室 心肌 钙 钙通道 膜化钳术 Fura2
成年大鼠心室肌细胞的急性分离是心肌功能研究的常用技术,以往的分离方法步骤多,时间较长,消化酶用量较大[13]。笔者介绍一种更为简便实用的改良Langendroff法,经主动脉消化酶恒流循环灌流的成年大鼠心室肌细胞的急性分离技术,并应用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的Ca2+电流(ICa)以及异丙肾上腺素对ICa的影响以检测其电生理学特性,通过观察电刺激对心室肌细胞胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响实验,介绍细胞动态荧光成像系统的使用方法。
1材料与方法
材料
动物健康SD大鼠,雄性,体质量250~300 g(上海斯莱克实验动物有限公司)。
主要试剂与仪器胶原酶I(1750 U/mL,美国Gibicol公司),蛋白酶ⅩⅣ( mg/mL,美国Sigma公司)。河豚毒(TTX,美国Calbiochen公司)。异丙肾上腺素(Iso,美国Sigma公司)。Fura2AM，20%Pluronic酸(美国Molucular Probe公司)。膜片钳放大器(Axopatch200B，美国Axon公司)，电流信号用Clampex 和Clampfit 软件(美国Axon公司)记录和分析。动态细胞荧光成像系统组成:DeltaRAM X高速荧光光源(美国PTI公司),CCD(电荷藕合器件图像传感器（Charge Coupled device,CCD,CoolSnap ES,德国Roper Scientific公司),光电倍增管(PMT,美国PTI公司),荧光图像或荧光强度分别用ImageMaster 和FeliX 32软件记录与分析(美国PTI公司)。倒置显微镜(T2000U,日本Nikon公司),超级荧光型油镜(CFI S Fluor 40×油镜,数值孔径为,日本Nikon公司)。
方法
急性心室肌细胞分离大鼠腹腔注射肝素(250 IU/100 g),5 min后氨基甲酸乙酯(1 g/kg)腹腔麻醉。迅速开胸摘取心脏,置盛有37 ℃预热的台氏液100 mL的培养皿中。台氏液成分如下(mmol/L):137 NaCl,2 CaCl2, KCl,1 MgCl2,10 glucose和10 Hepes(pH )。清洗血液,剪除残余肺叶与脂肪组织,迅速行主动脉插管。将心脏悬挂于Langendroff灌流装置上,结扎主动脉于插管上。采用恒流泵(6 mL/min)经主动脉插管逆向灌流冠脉血管床,先用无Ca2+台氏液灌流3~5 min,冲洗心室内残留的血液,换用含胶原酶I 20 mL和蛋白酶ⅩⅣ的无Ca2+台氏液循环灌流12 min,最后用含 mmol/L Ca2+台氏液灌流5 min冲洗消化酶,剪下心室,放入37 ℃预热的含 mmol/L Ca2+台氏液20 mL的培养皿中,用眼科剪剪开心室,并将心室在溶液中轻轻晃动以分散已解离的心室肌细胞。上述过程使用的灌流液需通入纯氧充分饱和,分离所得的心室肌细胞在室温(22 ℃) mmol/L Ca2+台氏液中可存活8~10 h。实验时用吸管把心室肌细胞混悬液加入含2 mmol/L Ca2+台氏液培养皿中,5 min后心室肌细胞即可贴壁,进行全细胞膜片钳记录,或细胞Ca2+浓度检测。
全细胞膜片钳技术检测电刺激引起ICa方法参考文献。细胞外液使用台氏液,加入10 μmol/L TTX以阻断Na+通道。电极经拉制和热刨光后,其尖端的电阻为3~5 MΩ,电极内液成分为(mmol/L):105 CsCl,10 NaCl,5 MgATP,10 Hepes,20 TEACl,4 EGTA和2 CaCl2(pH )。电信号经5 kHz滤波放大后,用Clampex 和Clampfit 软件记录和分析,以观察电刺激引起的ICa以及1 μmol/L Iso对ICa的影响。
心室肌细胞[Ca2+]i的检测 用可透膜的Ca2+敏感的荧光染料Fura2 AM检测[Ca2+]i,Fura2AM溶解于20%Pluronic酸的DSMO中。室温下,心室肌细胞在台氏液中用Fura2 AM(终浓度5 μmol/L)负载40 min后,用台氏液充分冲洗细胞外Fura2AM,并静置15~30 min以使胞内染料完全去酯化。由DeltaRAM X波长可选择的高速荧光光源输出波长为340 nm/380 nm,带宽为5 nm,340 nm/380 nm间的转换时间为3 ms,激发光经倒置显微镜的超级荧光型油镜后,作用于心室肌细胞,产生的发射光经带通滤镜(510/40 nm)后,分别由荧光CCD或光电倍增管输入计算机,荧光图像或荧光信号比率(RF340/F380)分别用Image Master 和FeliX 32软件记录与分析。细胞动态荧光成像和强度系统见图1。
2结果
大鼠心室肌细胞40倍油镜下观察,在 mmol/L Ca2+台氏液中分离的心肌细胞为棒状,心室肌细胞长约80~150 μm,宽约10~25 μm。良好的单个心肌细胞呈杆状或矩形,心室肌细胞横纹清楚,少部分有自发性收缩,而死细胞呈圆团状,使用本分离法心室肌细胞存活率为60%~80%,在含2 mmol/L Ca2+的台氏液中大部分心室肌细胞呈静息状态(图2)。
心室肌细胞ICa的检测心室肌细胞膜电位钳制电位在-60 mV,使用阶跃脉冲(由-60 mV迅速跃迁至0 mV,幅度:60 mV,时程:200 ms)刺激心室肌细胞,可记录到约 nA内向电流。加入1 μmol/L Iso 5 min后,电刺激引起的内向电流显着增大达 nA,提示急性分离的心室肌细胞具有良好的电生理特性。
工作模式下心室肌细胞[Ca2+]i的检测及电刺激时的变化在CCD工作模式下,曝光时间200 ms,Binning模式:4×4(像素348×260),采样间隔1 s;激发光波长为340 nm/380 nm时,所记录的心室肌细胞荧光图像及电刺激(波宽10 ms,强度5 V,频率1 Hz)时,荧光强度变化和刺激停止后的恢复见图4A,荧光强度比值RF340/F380的变化见图4B。
工作模式下心室肌细胞[Ca2+]i的检测及电刺激时的变化在PMT工作模式下(采样间隔 ms),激发光波长分别为340 nm/380 nm时,检测电刺激(参数:波宽10 ms,强度5 V,频率
　　A:F340和F380分别为激发光波长为340 nm和380 nm时,心室肌细
胞荧光强度的变化,曲线上方的附图分别为实验第2 s、15 s和25 s时荧光图片.↑:刺激开始(第8 s),↓:刺激结束(第15 s),刺激参数:频率为1 Hz,波宽10 ms,强度5 V. B:RF340/F380:激发光波长为340 nm和380 nm时,心室肌细胞荧光强度比率的变化曲线.
3讨论
新鲜分离心肌细胞形态与功能新鲜
分离的心室肌细胞形态正常,横纹清楚,在 mmol/L Ca2+的台氏液中偶可见心室肌细胞的自发性收缩,存活时间达8~10 h。与其他实验室的分离方法比较[13],本方法制备速度快(20 min),操作简单,仅用两种溶液,配液简单,酶用量较省且存活率较高。为检测所制备心室肌细胞的生理功能,笔者进一步使用全细胞膜片钳技术记录ICa,由于细胞外液存在的河豚毒(10 μmol/L TTX)可阻断细胞膜上的Na+通道,也就阻断了细胞膜上的Na+电流(INa);在细胞内液中存在20 mmol/L TEA,并用CsCl取代KCl,可阻断细胞膜上K+通道和K+电流(Ik),因此在阶跃脉冲作用下记录到的内向电流为ICa,Iso是特异性β肾上腺素受体激动剂,可激活心室肌细胞上的β肾上腺素受体,引起ICa增加,加入1 μmol/L Iso 5 min后,电刺激引起的ICa显着增大,提示采用本方法急性分离的心室肌细胞具有良好的电生理特性。
细胞荧光成像和强度检测技术的应用本测技术是当前细胞分子水平研究功能的主流技术。CCD以图像的方式,
PMT以荧光强度的方式,动态地记录细胞的荧光变化。这两个系统的主要功能相同,区别在于前者以图像表示,直观,可以分析单细胞的荧光分布变化,但探测荧光图像速率慢,适用于信号变化较慢的平滑肌细胞等。后者虽以荧光强度值的方式表示,不够直观,只能分析多细胞荧光变化,但灵敏度高,采样时间快,适用于信号变化较快的心肌细胞、神经细胞等。
动态细胞荧光成像和强度系统(美国PTI公司)兼有上述2种功能,具有如下特点:(1)高速动态连续可调波长荧光光源,激发光波长的选择范围为290~610 nm,带宽调节范围~25 nm,波长递增速率1 nm,不同波长激发光的切换时间为3 ms,并能同时输出10个不同波长的激发光。(2)荧光成像系统选用CoolSnap ES型CCD记录荧光图像,双激发光/单发射光时荧光图像探测速率为15比率/秒。(3)在PMT模式下,双激发光/单发射光时速率探测为250比率/秒;单激发光/单发射光时探测的速率可达1 000次/秒。
在CCD模式与PMT模式下分别检测心肌细胞Ca2+浓度变化笔者选用Fura2AM为双激发波长的荧光染料,Fura2和Ca2+Fura2激发光波长不同,分别为380 nm和340 nm,但发射光波长相同均为510 nm。在静息状态下,由于细胞内静息[Ca2+]i水平较低(100 nmol/L),因此细胞内游离Fura2浓度高,而Ca2+Fura2浓度则较低,因此,在380 nmol/L激发光作用下获得较强的荧光图像,而在340 nm激发光作用下,细胞的荧光强度较弱。电刺激可开放细胞膜上的Ca2+通道,使细胞外Ca2+内流,[Ca2+]i增加,Ca2+Fura2浓度也相应增加,则340 nm激发的荧光强度显着增加,同时游离的Fura2水平则减少,380 nmol/L激发的荧光强度减弱,而它们的荧光强度比值RF340/F380可更灵敏地反映电刺激时细胞内Ca2+水平的动态变化(图4)。Ca2+瞬变的快速变化相(锋值)时程较短(200 ms),而在CCD工作模式下,由于CCD对荧光信号的敏感性较弱,在CCD曝光时间设置为200 ms/帧时,需要400 ms才能检测到比率信号,因此无法检测到Ca2+瞬变锋值,图4中在刺激期间(8~15 s)荧光强度升高,是由于刺激引起收缩期细胞外Ca2+内流和SR的Ca2+释放,引起的细胞内Ca2+水平增高,而又不能及时转运至细胞外和SR,引起舒张期[Ca2+]i也比静息水平增高,Ca2+Fura2浓度增加,荧光强度增强。在PMT工作模式下,采样时间为 ms(15点/秒),则可检测到电刺激( Hz,10 ms和5 V)引起的Ca2+瞬变锋值(图5),提示PMT模式适用于荧光信号变化较快的心室肌细胞。
荧光图像/荧光强度比率可反映心室肌细胞[Ca2+]i水平,[Ca2+]i的变化,可以来自细胞外Ca2+的内流,也可由细胞内Ca2+池的Ca2+释放所引起,通过进一步的实验,如通过比较在有Ca2+和无Ca2+细胞外液条件下的荧光图像强度,或比较存在和不存在特异性Ca2+通道阻断剂条件下的细胞荧光强度的变化,可以区别[Ca2+]i升高的来源[68]。PTI动态细胞荧光成像系统可在透射光下用于观察心室肌细胞的形态(图2),在CCD工作模式下检测细胞荧光变化的分布区域(图4A);在PMT的工作模式下快速动态检测细胞荧光比率的变化(图5)。
比较全细胞膜片钳检测技术与动态细胞荧光成像技术,可发现前者无论理论基础还是技术操作方面,难度都很大,需要长时间的训练才能掌握。全细胞膜片钳技术对研究电压依赖性通道丰富的心肌细胞和神经细胞是不可或缺的技术,但对电压依赖性通道不是主要成分平滑肌细胞、内皮细胞等,动态细胞荧光成像技术可很好反映细胞内离子度浓度变化和离子透膜的转运过程。
笔者采用的急性分离大鼠心室肌细胞法简便实用,能在20 min内分离心室肌细胞,且符合全细胞膜片钳和动态细胞荧光成像技术的检测要求。
【参考文献】
“[1“]牛拴成,张轩萍 ,梁宏亮,等. 大鼠心肌细胞急性分离方法“[J“]. 山西医科大学学报, 2002,33(2):173174.
“[2“]裴建明,朱妙章,王跃明,等. 如何简单分离和选定心肌细胞“[J“]. 心脏杂志, 2002,14(6):548549.
“[3“]王云英,张然,余志斌. 低压恒流灌流分离成年大鼠心肌细胞“[J“]. 中国应用生理学杂志, 2005,21(4):475479.
“[4“]Sham J S K,Spencer C I. Practical aspects of confocal imaging of calcium sparks and cytoplasmic calcium concentration. Ion channel in the pulmonary vasculature. In:Yuan J X J. Ion channels in the pulmanory vasculature“[C“]. London:Taylor and Francis Group, 2005:733750.
“[5“]Spencer C I, Sham J S K. Effects of Na+/Ca2+ exchange induced by SR Ca2+ release on action potentials and after depolarizations in guinea pig ventricular myocytes“[J“]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003,285(6):H25522562.
“[6“]Lin M J,Leung G P H.,Zhang W M,et al. Chronic hypoxiainduced upregulation of storeoperated and receptoroperated Ca2+ channels in pulmonary arterial smooth muscle cells: a novel mechanism of hypoxic pulmonary hypertension“[J“]. Circ Res, 2004,95(5):496505.
“[7“]Zhang W M,Yip K P,Lin M J,et al. Endotheliun1 activates Ca2+ spark in pulmonary arterial smooth muscle cells: local Ca2+ signaling between inositol triphosphate and ryanodinereceptors“[J“]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2003,285(3):680690.
“[8“]Lin M J,Yang X R,Cao Y N,et al. Hydrogen peroxide induced calcium mobilization in pulmonary arterial smooth muscle cells“[J“]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007,292(6):15981608.