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中国中医急症 2023年1月第32卷第1期JETCM.Jan.2023，Vol.32，No.1 研究报告 天香丹对动脉粥样硬化模型小鼠TLR4/NF-B信号通路的影响张华1苗文艳2徐正伟1叶成辉1安冬青2，3（1.新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州中医医院，新疆 昌吉 831100；2.新疆医科大学，新疆乌鲁木齐 830000；3.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830000）中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1004-745X（2023）01-0047-04doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2023.01.010【摘要】目的 通过研究天香丹对动脉粥样硬化（AS）模型小鼠Toll样受体-4（TLR4）/核因子-B（NF-B）信号通路及相关炎症因子的影响，探讨天香丹防治AS的可能机制。方法 选取8周龄ApoE-/-小鼠30只予以高脂饲料喂养12周，造模成功后随机分为模型组、他汀组、天香丹组，每组10只；另取10只C57BL/6J小鼠予以普通饲料喂养作为空白对照组。他汀组、天香丹组分别以相应药液3 mg/kg、2.7 g/kg灌胃干预，空白组、模型组以0.5 mL蒸馏水灌胃，每日1次，连续12周。取小鼠血清用于检测血脂水平及TLR4、NF-B、肿瘤坏死因子-（TNF-）含量，取主动脉用于观察主动脉病理变化情况。结果 1）HE染色结果显示：他汀组、天香丹组病理改变较模型组轻，斑块稳定性提高，模型组主动脉斑块面积（PA）与管腔面积（LA）比值显著大于空白组（P 0.01），他汀组、天香丹组PA/LA比值则小于模型组（P0.01）。2）血脂检测结果显示：较空白组，模型组三酰甘油（TAG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）明显升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）明显降低（P0.01）；与模型组比较，他汀组、天香丹组TAG及TC降低明显（P0.01），天香丹组HDL-C升高（P0.01）、LDL-C降低（P0.01）。3）ELISA结果显示：模型组血清中TLR4、NF-B、TNF-含量均高于空白组（P0.01），他汀组、天香丹组血清中TLR4、NF-B、TNF-含量均低于模型组（P0.01）。结论 天香丹具有防治AS的作用，其机制可能与调控TLR4/NF-B信号通路、抑制炎症反应有关。【关键词】动脉粥样硬化天香丹Toll样受体-4核因子-B小鼠Effects of Tianxiang Dan on TLR4/NF-B Signaling Pathway in Atherosclerosis Model MiceZhang Hua，Miao Wenyan，Xu Zhengwei，Ye Chenghui，An Dongqing.TCM Hospital of Changji Hui Autonomous Prefecture，Xinjiang，Changji 831100，China.【Abstract】Objective：To observe the effect of Tianxiang Dan on the toll-like receptor-4（TLR4）/nuclear factor-B（NF-B）signaling pathway and related inflammatory factors in atherosclerosis（AS）model mice，and to explore the possible mechanism of prevention and treatment of AS by Tianxiang Dan.Methods：30 8-week-oldApoE-/-mice were selected and fed with high-fat diet for 12 weeks.After successful modeling，they were randomly divided into the model group，statin group，and Tianxiang Dan group，with 10 mice in each group；another 10C57BL/6J mice were fed with normal feed as the control group.The statin group and Tianxiang Dan group weregiven the corresponding drug with 3 mg/kg，2.7 g/kg，and the blank group and model group were intragastrically administered with 0.5 mL of distilled water，once a day，for 12 weeks.The serum of the mice was used to detect theblood lipid level and the content of TLR4，NF-B and TNF-，and the aorta was used to observe the pathologicalchanges of the aorta.Results：HE staining results showed that the pathological changes in the statin group andTianxiang Dan group were lighter than those in the model group，and the plaque stability was improved.The ratioof aortic plaque area（PA）to lumen area（LA）in the model group was significantly greater than that in the blankgroup（P0.01），the ratio of PA/LA in the statin group and Tianxiang Dan group was lower than that in the modelgroup（P0.01）.The blood lipid detection results showed that compared with the blank group，the model group hadsignificantly higher TAG，TC，LDL-C，and significantly lower HDL-C（P 0.01）；compared with the model group，基金项目：新疆维吾尔自治区卫生健康青年医学科技人才专项（WJWY-202235）；新疆维吾尔自治区自然科学基金（2021D01F60）通信作者（电子邮箱：）-47中国中医急症 2023年1月第32卷第1期JETCM.Jan.2023，Vol.32，No.1TAG and TC in the statin group and Tianxiang Dan group decreased significantly（P0.01），while the HDL-C increased（P0.01）and LDL-C decreased（P0.01）in the Tianxiang Dan group.ELISA results showed that the serum levels of TLR4，NF-B and TNF-in the model group were higher than those in the blank group（P0.01），and the serum levels of TLR4，NF-B and TNF-in the statin group and Tianxiang Dan group were lower thanthose in the model group（P0.01）.Conclusion：Tianxiang Dan has the effect of preventing and treating AS，andits mechanism may be related to the regulation of TLR4/NF-B signaling pathway and the inhibition of inflammatory response.【Key words】Atherosclerosis；Tianxiang Dan；TLR4；NF-B；Mice动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）已成为全球人口死亡的首要原因，炎症反应贯穿了动脉粥样硬化（AS）发生发展的始终1-3。研究表明，当组织受损时，可诱导免疫反应从而激活Toll样受体-4（TLR4），引起核因子-B（NF-B）磷酸化，介导下游因子发生炎症反应、导致内皮功能障碍，最终导引发AS4-6。目前针对CVD的治疗，即使是降血脂、抗血小板与控制血压的药物也只能降低部分CVD事件发生的风险7-9，且存在一定的副作用，所以仍缺乏积极有效的防治措施。AS的发生多由内外之邪引发脏腑功能失调、气血津液运行障碍导致，治疗可运用清热解毒且气味芳香、性善走窜之品清解“内外之毒”。天香丹是名老中医张绚邦教授以通补开泄法为理论总结而成的经验方，该方以新塔花为君，红景天、丹参为臣，佐以降香4味中药按特定比例组成，有化痰散结、益气补虚、和血通络的作用，可用于防治AS性心血管疾病。临床研究表明，其在调节血脂代谢、保护内皮细胞、抑制炎症反应等方面疗效确切，但防治AS机制尚需进一步研究10-14。本研究通过建立AS小鼠模型进行药物干预，后期进行病理学实验、分子生物学实验观察TLR4/NF-B通路下游相关炎症因子、血脂水平指标、血管病理性变化等，旨在为中医药防治AS性心血管病、开发新的中医药资源提供科学依据。现报告如下。1材料与方法1.1实验动物8 周龄雄性载脂蛋白 E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠 30只，普通C57BL/6J小鼠10只，平均体质量（18.002.00）g，均由北京维通利华公司购入，许可证号：SCXK（京）2016-0011。饲养于新疆医科大学医学动物实验中心SPF环境，并通过伦理委员会审批，编号：MEC-20210214-001。1.2试药与仪器阿托伐他汀（北京Solarbio公司，批号：20151223）；天香丹（新疆医科大学第四临床医院，批准号：新药制字ZO4000820）。高脂饲料（成分：基础饲料82.68%、猪油10%、猪胆盐0.2%、胆固醇2%、蔗糖5%、丙硫氧基嘧啶0.12%），由新疆医科大学动物中心加工而成。小鼠 TLR4 ELISA 试剂盒（美国 EBioscience）、小鼠NF-B ELISA试剂盒（美国EBioscience公司）、小鼠肿瘤坏死因子-（TNF-）ELISA试剂盒（美国EBioscience）、HE染色试剂盒（G1120，北京Solarbio）等。PM-401 石蜡熔蜡箱（日本 SAKURA）；5235 组织 包埋机（日本 SAKURA）；LKB-V 切片机（瑞典LKB）；低温高速离心机（德国Eppendrof）；DM 2500光学显微镜（德国LEIC）；Type 1500多功能酶标仪（美国Thermo）等。1.3造模与分组所有小鼠于SPF级环境适应性喂养1周后，高脂饲料继续喂养8周建立动脉粥样硬化模型。以ApoE-/-小鼠为标准，肉眼观察见小鼠反应迟钝，精神倦怠，皮毛干枯无光泽且稀疏，体质量增加明显。病理学实验，镜下观察见小鼠主动脉内膜纤维性增厚钙化，管腔狭窄明显，平滑肌细胞排列紊乱，有脂质沉积，出现胆固醇结晶或粥样斑块等。以上证实AS模型制备成功。造模成功后，将C57BL/6J小鼠设为空白对照组，ApoE-/-小鼠随机分为模型组、他汀组和天香丹组，每组10只。1.4给药方法根据成人临床常用量等效换算15，小鼠实验用药量=9.1成人临床常药量 g/（kgd）。将药物溶于0.5 mL蒸馏水（小鼠最大灌胃剂量0.4 mL/10 g）灌胃，每日1次，每周根据体质量变化调整剂量。他汀组灌胃阿托伐他汀药液3 mg/（kgd）、天香丹组灌胃天香丹药液2.7 g/（kgd），模型组和空白组灌胃0.5 mL蒸馏水，持续12周。所有小鼠SPF环境喂养，不限饮食饮水，活动自由。1.5标本采集与检测第12周末，禁食不禁水12 h，小鼠麻醉后眼球取血至EP管内，7 500 r/min离心15 min取上清，-80 冰箱保存；无菌条件下迅速打开胸腹腔，取胸腹主动脉置于4%多聚甲醛中固定。1）血脂检测。自动生化仪测量血清CHO、三酰甘油（TAG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。AS指数（AI）=（CHO-HDL）/HDL。2）HE染色和斑块面积分析。取甲醛固定的主动脉依次经过组织包埋、固定、脱水、切片、染色、拍照等步骤，利用图像分析软件测量阳性面积，计算主动脉斑块面积（PA）/管腔面积（LA）值，观察病变部位及形态学变化。3）ELISA法测血清中TLR4、NF-B、TNF-含量，试剂盒测定各组小鼠血清中细胞因子TLR4、NF-B、TNF-表达水平，以酶标仪450 nm波长为条件，计算出相应因子的浓度值。-48中国中医急症 2023年1月第32卷第1期JETCM.Jan.2023，Vol.32，No.11.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（xs）表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较方差齐采用LSD法，方差不齐采用非参数检验（Tamhanes T2）。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组小鼠体质量和一般情况比较见表1。灌胃第12周末，空白组小鼠对外界刺激反应灵敏，暴躁好斗，皮毛干净，饮食饮水及二便正常，体质量增加不显著。模型组小鼠对外界刺激反应迟钝，喜静少动，皮毛干枯无泽且脱落，饮食饮水较模型组降低，体质量较空白组增加明显（P 0.01）。与模型组比较，他汀组、天香丹组小鼠均表现喜静少动，皮毛干枯有脱落，饮食饮水减少，体质量增加缓慢，差异有统计学意义（P 0.05）。2.2各组小鼠血清血脂水平比较见表2。与空白组比较，模型组TAG、TC、LDL-C明显升高，HDL-C明显降低，差异有统计学意义（P 0.01）。与模型组比较，他汀组、天香丹组TAG及TC降低明显，差异有统计学意义（P 0.01），天香丹组HDL-C升高，LDL-C降低，差异有统计学意义（P0.05）。他汀组与天香丹组小鼠血脂水平比较差异无统计学意义（P0.05）。2.3各组小鼠主动脉形态学变化见图1、表3。所有小鼠均见AS的形成，管腔出现不同程度的狭窄。空白组小鼠主动脉壁未见明显平滑肌细胞增生，未见胆固醇结晶形成，少量狭窄。模型组斑块增多，主动脉壁厚度明显不均匀，局部发生钙化，外膜可见大量炎性细胞浸润及斑块形成，PA/LA 比值显著大于空白组（P 0.01）。他汀组、天香丹组主动脉管壁厚度不均匀，内膜增厚，但小于模型组，外膜内可见少量炎性细胞浸润，病理改变较模型组轻，两组PA/LA比值均小于模型组（P 0.05）。2.4各组小鼠血清细胞因子TLR4、NF-B、TNF-水平比较见表 4。模型组小鼠血清 TLR4、NF-B、TNF-含量较空白组明显升高，差异有统计学意义（P 0.01）；与模型组比，他汀组、天香丹组小鼠血清TLR4、NF-B、TNF-含量均明显降低，差异有统计学意义（P0.01或P0.05）。3讨论中医根据AS临床症状将其归属于“胸痹”“真心痛”“脉痹”“中风”等范畴。名老中医张绚邦教授认为，该病组 别空白组模型组他汀组天香丹组n10101010初始体质量18.021.1318.012.0518.103.3018.060.92灌胃第2周19.260.3521.410.57*20.061.1220.521.26灌胃第6周24.241.1728.112.10*25.061.2026.311.51灌胃第12周27.221.3135.652.35*29.341.1530.221.35表1各组小鼠体质量变化比较（g，xs）注：与空白组比较，P0.05；与模型组比较，P0.05，P0.01。下同。组 别空白组模型组他汀组天香丹组n10101010TAG0.640.011.340.07*0.970.080.850.15TC2.750.0415.321.01*13.532.869.810.08HDL-C2.170.100.620.01*0.630.080.990.07LDL-C0.360.065.840.94*6.040.193.860.33表2各组小鼠血清血脂水平比较（mmol/L，xs）空白组模型组他汀组天香丹组图1各组小鼠主动脉病理观察（HE染色，200倍）组 别空白组模型组他汀组天香丹组n10101010PA/LA（%）0.120.040.670.19*0.230.150.250.10表3各组小鼠主动脉PA/LA值比较（xs）组 别空白组模型组他汀组天香丹组n10101010TLR41.040.387.541.76*2.050.573.900.76NF-B1.070.165.931.70*1.790.632.010.71TNF-706.65100.171 655.54258.98*1 219.68150.871 248.46149.83表4各组小鼠血清TLR4、NF-B、TNF-水平比较（pg/mL，xs）-49中国中医急症 2023年1月第32卷第1期JETCM.Jan.2023，Vol.32，No.1病机为本虚标实，本虚为心肝之血、肺脾肾精元之气不足，标实为气滞血瘀痰阻，治当以通补开泄为法。天香丹为通补开泄法代表方，口服疗效较好，临床运用三十余年，在抗AS、改善心肌缺血等方面具有良好疗效。国内外对于TLR4/NF-B信号通路的报道很多。NF-B是一种特殊蛋白，它首先成熟在B细胞和浆细胞中，并广泛存在于人体组织细胞中。在AS病变过程中，其主要特征是血管壁发生炎症反应。越来越多的研究表明16-17，TLR4在CVD的最初发展中起着重要作用，即使在斑块不稳定及破裂过程中亦是如此，其介导的TLR4/NF-B信号通路已成了治疗CVD的新靶点。当出现组织受损时，TLR4通路被活化，从而激活NF-B，释放大量的炎症因子，出现内皮功能障碍、炎症、血管壁变薄等，增加不稳定性因素，引起斑块的破裂和血栓形成，导致心血管病事件发生 18-19。课题组前期研究表明12-14，天香丹能够有效缓解心绞痛的发作，调节血脂水平，以及提高患者血清内皮生长因子含量，保护内皮细胞受损，刺激内皮细胞增殖。本研究结果显示，通过高脂饲料喂养可成功建立AS小鼠模型，而天香丹组小鼠体质量较模型组偏低，血脂有所改善（P0.01），主动脉炎性浸润及脂质沉淀减少，血管内皮病理情况有所缓解，且未见明显斑块形成，天香丹组主动脉 PA/LA 比值小于模型组（P 0.05），这提示天香丹可能是通过降低TLR4/NF-B信号通路内蛋白水平，介导下游细胞因子，最终达到抑制炎症反应，防治AS的作用。总之，本研究基于炎症角度探讨了天香丹防治AS的机制，对今后中医药抗AS寻找新的靶点进行了探索，认为其抗AS效果可能与调控TLR4/NF-B信号通路介导的炎症反应有关，但并不能确定天香丹抑制炎症为其防治AS的唯一途径。天香丹内具体哪些成分起到了靶向作用，还需对药效学和机制展开深入研究。利益冲突：所有作者均声明不存在任何利益冲突。参考文献1 Virani SS，Alonso A，Benjamin EJ，et al.Heart disease andstroke statistics-2020 update：a 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