贝类中神经性贝类毒素检验方法—小鼠生物法_编制说明.doc

出入境检验检疫行业标准草案编制说明的编写模版
1 基本信息
1.1 标准草案名称
中文
贝类中神经性贝类毒素检验方法 小鼠生物法
英文
Determination of neurotoxic shellfish poisons in shellfish
Mouse biology method
1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况
等同√
修改
非等效
标准号
APHA，1985
英文名称
Method for Ptychodiscus brevis toxins. In: Laboratory Procedures for the Examination of Seawater and Shellfish.5th ed. Washington, D.C., American Public Health Association, PP.64-80.
中文名称

1.3 任务来源
批准立项的文件名称和文件号
国认科函2009212号
计划编号
2009B753r
1.4 制（修）订情况
制订
修订√
替代的标准编号
SN 1573-2005
1.5 起止时间
2010年01月～2011年08月
1.6 起草单位
辽宁出入境检验检疫局
1.7 起草人
赵昕、王秋艳、田苗、徐静、郑秋月、曹际娟、徐杨
1.8 专业类别
√1、食品（化妆品）检验；2、卫生检疫；3、动物检疫；4、植物检疫；
5、纺织产品检验；6、轻工产品检验；7、机电产品检验；8、化工、矿产品和金属材料检验；9、管理；10、鉴定；11包装及危险化学品
1.9 标准体系表代码

1.10 调整情况

2 背景情况
2.1 目的、意义
贝类毒素属海洋天然有机物，它的形成与海洋中有毒藻类赤潮密切相关。据文献报道，能形成赤潮的微藻约有184~267种，其中有毒微藻约为60~78种。有毒藻类产生的毒素往往通过食物链进入贝类体内，因而通常称这些毒素为贝毒，人们食用带有贝毒的贝类造成中毒。神经性贝毒（neurotoxic shellfish poison，NSP）是海洋贝类毒素中引起赤潮最主要的一种，中毒严重者可危及生命。神经性贝毒中毒症状主要是中枢神经发生障碍，其安全限值为0.2MU/g。神经性贝类毒素是化学结构以短裸甲藻毒素（brevetoxin）为代表。神经性贝毒引起中毒的途径有两条，一是经由贝类作为传递媒介，人食用后表现出神经中毒的症状；另外在有短裸甲藻赤潮发生时，波浪运动形成的有毒气溶胶可能进入人的呼吸系统引起类似气喘的症状。除对人类的影响之外，短裸甲藻毒素还导致了大量的鱼类死亡事件。与麻痹性贝毒阻断Na离子内流相反，神经性贝毒的活性成分短裸甲藻毒素可以诱导钠离子内流，从而导致肌肉和神经细胞的去极化。目前常见的NSP检测技术分别为：小白鼠生物试验法、HPLC法、酶联免疫法。小白鼠生物试验法是目前得到国际公认的金标准，被许多国家接受和采用，我国目前也采用该方法对贝毒实施检测。但是原标准中有一些内容适合，需要重新加以修定。

2.2 与国内外相关标准、文献的关系
等同采用APHA protocol（the Americation Public Health Association）
3 编制过程
3.1 准备阶段（可选项）
标准的制定过程主要分为计划阶段、资料收集分析阶段、标准方法的验证、标准编写、标准征求意见和标准报批。各阶段主要工作工程分述如下：
计划阶段：2010年1月-3月是项目计划制定阶段。项目负责人组织相关人员，成立了制定《贝类中神经性贝类毒素检验方法》行业标准的起草小组。起草小组召开了标准制定计划会议，大家讨论了本标准的意义及实施方案，并对本标准的工作内容进行分解，制定完善的实施计划和进度表，并落实到人。
资料收集分析阶段：从2010年4月开始，项目组根据分工通过搜索互连网、查阅文献资料等手段在原课题的基础上进一步收集当前国内外有关贝类毒素检测的各种法规、标准及文献，为本项目的顺利进行打下了良好的基础。
标准方法的验证：工作组就小鼠生物测定法中分散介质的安全性，测试方法的回收率及灵敏度等方面进行考察，建立了可行、稳定的检验方法。并组织多家单位对本项目进行方法验证。
标准编写：2011年1月通过课题组集中讨论的方式确定标准制定原则及基本框架，按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》要求，完成了“贝类中神经性贝类毒素检测方法——小鼠生物法”标准初稿。

3.2 分工情况
赵昕：负责标准总体构架的设计和标准编写的组织实施，组织调研、收集相关的资料和标准，负责本标准的撰写；全面负责标准的审查；负责组织和审查该标准编制说明等相关文件；组织专家研讨、标准的使用验证和推广。
王秋艳：完成标准的编写、修改、实施等具体工作。负责标准的资料收集；参与起草了本标准；负责标准征求意见的汇总和采纳工作；负责起草了该标准编制说明等相关文件；参与完成了专家研讨、标准的验证和推广工作。
田苗等人参与完成标准的编写、修改、实施等具体工作。参与标准的资料收集；参与完成了专家研讨、标准的验证和推广工作。

3.3 标准草案编写情况
2011年1月通过课题组集中讨论的方式确定标准制定原则及基本框架，按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》要求，完成了“贝类中神经性贝类毒素检测方法——小鼠生物法”标准初稿。
3.4 征求意见情况（适用于送审稿）

3.5 审定情况
（适用于报批稿）

3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）
技术类标准
4 主要技术内容的确定
（1）修改了原标准的英文名称，使得标准更准确。
（2）增加了规范性引用文件，使得标准中使用水及实验动物的处置有了依据。
（3）修改了术语和定义中关于鼠单位的定义部分内容。原有的鼠单位定义不准确，不适用于神经性贝类毒素。依据： American Public Health Association. Method for the bioassay of Gymnodinium breve toxin(s) inshellfish. In Recommended Procedures for the Examination of Sea Water and Shellfish, 4thEdition; American Public Health Association: Washington, DC, USA, 1970, pp. 61-66.
（4）修改了样品保存和制备的部分内容，使得标准更有可操作性。
（5）删除了方法提要中“采用Brevetoxin-2作为标准品”这段文字，因本标准是小鼠生物法，最后的报告单位是MU，且神经性贝类毒素标准品在我国很难获得，删除后使得标准更有可操作性。
（6）根据APHA内容对标准检验步骤的内容进行了修改。
（7）修改了结果报告中的内容。将原标准中“若小鼠的死亡时间大于930 min，结果报告为小于0.1 MU/g。 若小鼠的死亡时间小于930 min，结果按照5.1计算得到实际结果报告。”改为：在空白对照组小鼠正常的情况下进行如下判断和表述：
若小鼠的死亡时间大于360 min，则待测样品的鼠单位即相当于0.2 MU/g。
若实验组中位数死亡时间小于120 min，则应对样品提取液进行稀释，再选取3只小鼠进行试验，直至得到中位数死亡时间为120 min~360 min为止，根据最后的稀释液实验结果计算样品的鼠单位毒力，报告该样品的鼠单位为：××× MU/ g。
若实验组中位数死亡时间大于360 min，则直接计算确定样品鼠单位毒力，报告该样品的鼠单位为：××× MU/ g。
若实验组中所有小鼠在观察930 min内均不死亡，则也可报告该样品的鼠单位小于0.1 MU/ g。
理由：现在国内外关于神经性贝类毒素的限量标准是0.2MU/g,原标准中表述的过于简单。
（8）增加了健康和安全内容。
实验内容1.分散介质安全性检查
1.1分散介质样品的制备
以吐温80为溶质，以0.9%氯化钠生理盐水为溶剂，配制1%吐温80生理盐水。
1.2 动物实验设计
（1）选择健康ICR小鼠6只，雄性，18~22g。
（2）按规定暂养后，按体重随机分两组（1%吐温80生理盐水组和0.9%氯化钠生理盐水组），3只/组。
（3）小鼠腹腔注射染毒，0.5mL/10g体重，染毒后观察7天。
1.3分散介质安全性检查
根据上述试验结果确定分散介质的安全性。

表1. 分散介质安全性检查
组别
致死率
症状
1%吐温80生理盐水组
0
染毒30min内，动物有“扭体”反应，其后恢复正常
生理盐水组
0
小鼠活动正常，无异常反应
2.标准曲线的测定
2.1 标准物质测试样品的制备
以1%吐温80生理盐水为分散介质，以PbTx-2为分散相，在磁力搅拌器匀速搅拌下，配制混悬液，浓度分别为：40µg/mL、30µg/mL、20µg/mL、15µg/mL、10µg/mL、7.5µg/mL、5µg/mL、4µg/mL的溶液。
2.1 动物实验设计
（1）选择健康ICR小鼠27只，雄性，19-21g。
（2）规定暂养后，按体重随机分9组，3只/组。
（3）腹腔注射染毒，1.0 mL/只体重，染毒后观察930min。
2.2标准曲线的建立
以NSP浓度为横坐标、以中位数死亡时间的倒数为纵坐标，建立NSP小白鼠检测的标准曲线。
表2. NSP标准曲线的测定
NSP浓度
（µg/mL）
40
30
20
15
10
7.5
5
4
中位数死亡时间
（min）
7
13
15
36
220
380
720
921
Y＝0.0039X-0.0236 R2＝0.9555

3. 测试方法回收率的确定
3.1 模拟样品的制备
选取经“NSP的ELISA检测方法”检验确认未被NSP污染的文蛤肉为空白基质。
取两份上述文蛤肉100g，分别放入均质杯中，各加入分别含有PbTx-2标准品200µg和400µg的300mL乙醚中，均质3-5min，制成NSP 毒力分别为2µg/g肉和4µg/g肉的模拟样品A和B。
3.2模拟样品中NSP的提取
按照标准的方法分别提取模拟样品A和B中NSP，备用。
3.3 测试样品的制备
向3.2中过夜保存的蒸发瓶中各加入10mL达室温的1%吐温80生理盐水，振摇，使内容物充分混悬于液体分散介质中（注意瓶壁上不得有附着物）。
3.4 阳性对照液的制备
以10mL 1%吐温80生理盐水为溶剂，分别加入200µg和400µg PbTx-2标准品，充分混悬，制成相当于NSP毒力为20µg/mL和40µg/mL的阳性对照液A，B备用。
3.5阴性对照液的制备
以1%吐温80生理盐水为阴性对照液。
3.6动物实验设计
选择健康ICR小鼠15只，雄性，19-21 g。按规定暂养后，按体重随机分5组，3只/组。腹腔注射染毒，1.0 mL/只，染毒后观察930min。
3.7 测试方法的回收率试验
根据上述试验结果确定本试验建立方法的回收率。结果表明，本研究所建立的检测方法的回收率约为80%。

表3. 测试方法回收率
组别
中位数死亡时间
（min）
NSP含量
（µg/g）
回收率
（％）
阳性对照A
17
2.11
81.52
测试样品A
23
1.72
阳性对照B
9
3.45
79.42
测试样品B
12
2.74
阴性对照
>930
——
均值：80.47
4 测试方法灵敏度的试验
4.1 测试样品的制备
按3.1分别制备NSP含量为0.8µg/g肉、0.7µg/g肉、0.6µg/g肉、0.5µg/g肉、0.4µg/g肉、0.3µg/g肉的溶液的模拟样品。
4.2 NSP的提取
按照标准文本中的方法提取模拟样品中的NSP。
4.3 NSP毒力的测试
按3.6进行毒力测试。
4.4测试方法灵敏度的确定
根据上述试验结果确定本试验建立方法的灵敏度。
结果表明，本研究所建立的检测方法的灵敏度约为0.5µg/g。

表4. 测试方法灵敏度的试验结果
NSP含量
（µg/g）
中位数死亡时间
（min）
0.8
570
0.7
655
0.6
775
0.5
915
0.4
>930

5 验证情况（适用于方法类标准）
5.1 验证单位情况
验证单位
验证人员
验证时间
东港出入境检验检疫局
于杰
2011年7月6日
大连海洋大学
赵前程
2011年7月5日
丹东出入境检验检疫局
于兵
2011年7月5日
庄河出入境检验检疫局
黄大亮
2011年7月6日
锦州出入境检验检疫局
张旭东
2011年7月6日

XXXX年XX月XX日

XXXX年XX月XX日
5.2 验证过程
模拟样品的制备：选取经“NSP的ELISA检测方法”检验确认未被NSP污染的文蛤肉为空白基质。
取上述文蛤肉各1000g，放入均质杯中，加入含有PbTx-2标准品800µg的300mL乙醚中，均质3-5min，制成NSP 毒力分别为80µg/100 g肉的模拟样品。
每个验证单位发放100 g上述的模拟样品，按照标准文本的方法进行NSP提取及后续实验。报告实验结果。
5.3 验证数据分析
单位名称
实验结果MU/g
丹东出入境检验检疫局
0.2
东港出入境检验检疫局
0.2
大连海洋大学
0.2
锦州出入境检验检疫局
0.2
庄河出入境检验检疫局
0.2

5.4 验证评价
本标准适合于贝类中神经性贝类毒素检测，方法稳定，结果可靠，检测灵敏度高。

5.5 其他应说明的情况

6 附加说明（可选项）
6.1 宣贯标准的建议

6.2 修订和废除现行有关标准的建议
待本标准发布实施后，原有标准 SN 1573-2005 《贝类中神经性贝类毒素检验方法 小鼠生物法》相应废除。
6.3 作为强制性标准或推荐性的建议

6.4 其他需要说明的情况

6.5 参考文献
1.US Food and Drug Administration; Fish and Fisheries Products Hazards and Control Guide, 3rd Ed.; Center for Food Safety and Applied Nutrution, Office of Seafood, US Food and Drug Administration: Rockville, MD, 2001; pp. 74.
2. Red Tide Regulations; Technical Bulletin No. 2; Florida Department of Agriculture and Consumer Services: Tallahassee, FL, 2002.
3.American Public Health Association. Method for the bioassay of Gymnodinium breve toxin(s) in shellfish. In Recommended Procedures for the Examination of Sea Water and Shellfish, 4th Edition; American Public Health Association: Washington, DC, USA, 1970, pp. 61-66.
4. APHA，1985.Method for Ptychodiscus brevis toxins. In: Laboratory Procedures for the Examination of Seawater and Shellfish.5th ed. Washington, D.C., American Public Health Association, PP.64-80.
联系人
赵昕
联系电话
13050542111
电子邮箱
zhaoxin823@
注1：本模版表的共性部分为第1章、第2章、第4章和第6章。
注2：3.4适用于标准草案送审稿，3.5适用于标准草案报批稿，3.6中预期的管理目标适用于规程类标准，3.6中技术指标适用于方法类标准，第5章适用于方法类标准编制说明的编写。
注3：3.1和第6章为可选项，其余为必填项。
编写日期：2011年08月20日