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楮头红多糖的分离纯化与生物活性检验
【摘要】 目的 从药用植物楮头红中分离纯化多糖成分并验证其生物活性。方法 用热水提取，乙醇沉淀提取粗多糖，再经Sevag法去除蛋白，透析去除小分子物质，冷冻干燥得楮头红多糖粗品；采用DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-200凝胶柱层析进行分离纯化；用TBA法考察多糖的抗脂质过氧化作用；采用CCl4急性肝损伤模型，测定其血清中AST变化。结论 获得一个楮头红多糖组分。TBA法表明该组分对小鼠自发性脂质过氧化具有显着的抑制作用；在保肝试验中，给药组能明显抑制AST的升高，对肝损伤有一定的保护作用。
【关键词】 楮头红多糖；分离；纯化；生物活性
crude product of S. nepalensis Wall polysaccharide was prepared with hot water extraction,ethanol precipitation,dialyzation,and　crude polysaccharide was separated by DEAE-cellulose chromatography and purified by Sephadex G-200　inhibit effect of the polysaccharide on lipid peroxidation of mice liver was conducted by TBA　model of liver-injury induced by carbon tetrachloride，别名风柜斗草。《中药大辞典》记载：其性凉、味酸、无毒；功用：清肺热，去肝炎；《实用中草药》记载：其性平、味甘。功用：清热解毒、凉血利水。主治急性肝炎，肺热咳嗽。据有关临床使用报道：楮头红对急性肝炎疗效最佳，对慢性肝炎及乙肝病毒携带者有效［1，2］。楮头红已在福建省民间广为使用，是一种极有价值的天然中草药资源。前期研究表明，楮头红中含有游离苷类物质、黄酮类物质、酚类、鞣质类等物质，含量较高的多糖和较丰富的人体所必需的营养元素［3］。为了进一步研究楮头红的生理药理作用，在前期研究基础上，我们对楮头红多糖进行了分离纯化，对获得组分的生物活性进行了初步验证。
1 材料与方法
　仪器 电子天平，恒温水浴锅，低速大容量离心机，1600分光光度计，RE-52A旋转蒸发仪，MC99-3自动液相色谱分离层析仪，Agilent1100高效液相色谱仪。
　材料与试剂 楮头红；DEAE-52填料、sephadexG-200填料、透析袋、联苯双酯滴丸；石油醚、95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮、98%浓硫酸、氯仿、氯化钠、氢氧化钠、正丁醇等，均为分析纯。
　楮头红粗多糖的提取
　楮头红多糖的提取［4，5］ 楮头红全草用蒸馏水洗涤去土，40℃低温干燥、粉碎。称取草药250g,用石油醚80℃回流脱脂2次，之后用95%乙醇除小分子单糖，滤渣挥去酒精，晾干后于90℃回流提取3次，每次2h，合并滤液，离心去除不溶物。滤液加%的活性炭60℃保温30min，不断搅拌脱色，过滤，取上清液放入-40℃冰箱过夜，第二天取出自然融化后离心去除不溶物。上清液浓缩适当的体积后缓缓加入5倍量的95%乙醇沉淀，过滤，沉淀依次用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，重复3次。
　除蛋白［9］ 用Sevag法脱蛋白，氯仿正丁醇4：1，多糖溶液和混合液的体积比为3：1，混合搅拌20～30min，充分静止分层除去白色沉淀，数次后直至界面无白色沉淀。
　透析干燥 多糖复溶后透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与透析液体积比为1：20，4h换一次水。将透析液进行冷冻干燥后即得粗多糖。
　楮头红粗多糖的纯化分离［6～13］
　DEAE-52柱层析 DEAE-52填料依次用/L NaOH、/L HCl、/L NaOH处理，再以蒸馏水洗至中性后装柱。装柱后用蒸馏水平衡48h。将粗多糖溶于少量重蒸水，过柱，上样量为交换容量的10%～20%。用水、/L NaCl、/L NaCl梯度洗脱，用自动部分收集器每15min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测各主峰组分，将各主峰位分别收集合并，蒸馏水透析2天，冷冻干燥得楮头红多糖。
　Sephadex G-200 柱层析 将Sephadex G-200填料加适量蒸馏水浸泡12h，100℃煮沸4h，脱气后装柱，用/L NaCl平衡48h。将中收集的各主峰组分进一步纯化，用/L NaCI洗脱，自动部分收集器每30min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测。收集各主峰组分，冷冻干燥。
　HPLC 纯度验证 将多糖溶解成合适浓度，过μm的滤膜后进样，进样体积20μl，流速/min，示差检测器检测，柱温箱温度35℃。
　　　多糖的生物活性验证
　小鼠肝自发性脂质过氧化实验［14］ 小白鼠禁食18h，引颈法处死，迅速取出肝脏，用4℃下预冷的/L PBS洗去表面残血，滤纸吸干。用玻璃匀浆器将肝脏制成10%的肝匀浆。取该匀浆1ml，加不同浓度的多糖溶液600ul，对照管不加样品，用PBS作空白，于37℃温育2h，加入20%三氯乙酸1ml终止反应，3500r/min离心10min，取上清液2ml加入%硫代巴比妥酸1ml，90℃水浴15min，取出后流水冷却。于532nm处测A值，以不加肝匀浆和样液为比色空白样，以加肝匀浆不加样品为对照样，按下式计算脂质过氧化物的清除率：LPO的清除率=/A0×100
　多糖保肝活性试验［15］ 取50只健康小鼠，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。1-2组为给药高低剂量组，3组为联苯双酯阳性对照组，4组为CCl4模型组，5组为空白组。正式实验前，所有动物禁食不禁水12h。从第二天开始，每天1次，连续灌药15天，空白组和模型组灌的生理盐水，给药组灌同等体积的多糖，在最后一次灌药后1h，除空白组外，其余四组皮下注射%的四氯化碳-花生油溶液，禁食12h后立即摘除眼球采血。3500r/min离心，取上清液。测定血清AST活力。
2 结果与分析
　粗多糖DE-52柱层析结果 由图1可以看出，经DEAE-52柱层析，可以得到两个相对明显的组分，组分Ⅰ为水洗脱组分，组分Ⅱ为NaCl梯度洗脱的组分，且达到了较好分离效果。
图1 多糖梯度洗脱曲线 Sephadex G-200柱纯化结果 由图2可以看出，组分Ⅱ经两次过柱后，得到进一步纯化，可以看出其为单一组分，但其纯度还需进一步验证。
图2 组分Ⅱ在Sephadex G-200柱上的洗脱曲线
　组分Ⅱ过柱纯化后纯度验证 从图3可以看出，经DEAE-52纤维素柱和sephadex G-200凝胶柱纯化后的多糖组分Ⅱ，在HPLC图谱上只有一个峰，与前面凝胶色谱结果吻合，说明此组分相对均一。
图3 组分Ⅱ的HPLC图谱 楮头红多糖生物活性实验 小鼠肝自发性脂质过氧化实验结果表明，随着多糖浓度的增加其抗脂质过氧化能力逐渐增强，且在一定浓度范围内呈现剂量效应关系，当多糖浓度达到/ml时抑制率达到50%，显示了较强的抗氧化能力，这对于细胞免受过氧化损伤，维持细胞正常生理功能具有积极意义。
图4 楮头红多糖的抗脂质过氧化作用楮头红多糖保肝实验结果表明，楮头红多糖能够显着降低CCl4诱导的肝损伤小鼠中升高的AST活性，其作用可能与抑制膜脂质的过氧化，维持肝细胞膜的完整性，从而产生保肝作用有关。表1 楮头红粗多糖对CCl4肝损伤小鼠AST影响注：△与正常对照组比较；*与四氯化碳组比较。
3 讨论
采用水提醇沉法从药用植物楮头红中提取到水溶性粗多糖，经脱色、除蛋白、透析后，再经柱层析纯化后，得到一个高纯度的多糖组分。该组分对小鼠肝自发性脂质过氧化和肝损伤具有一定的保护作用。其他方面的生物活性，如增强免疫活性、抗病毒等作用，尚需要进一步研究确认。本研究为今后的楮头红多糖结构和生物活性研究奠定了基础，为开发楮头红多糖类药物提供了理论依据。
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