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人微小病毒B19感染与Kikuchi病的相关性
【摘要】 目的：研究人微小病毒B19感染与组织细胞性坏死性淋巴结炎(KFD)的相关性. 方法：采用双盲法在32例KFD患者及13例正常对照淋巴结活检组织中用原位杂交和免疫组织化学染色方法检测B19病毒基因组DNA和病毒蛋白. 并采用原位杂交和免疫组化双标记法确定病毒感染的细胞类型. 结果：在32例KFD患者淋巴结中，B19病毒DNA和病毒蛋白阳性率分别为%和%，而在对照淋巴结中，二者阳性率分别为%和%. 统计学分析显示B19病毒基因组DNA和病毒蛋白在KFD中有更高感染率(P值分别为和). 病毒感染的细胞大部分为淋巴细胞，少数组织细胞也是病毒感染的靶细胞. 结论：微小病毒B19在KFD中有更高的感染率，微小病毒B19与KFD的发病有密切关系.
【关键词】 组织细胞性坏死性淋巴结炎；微小病毒B19；原位杂交；免疫组织化学
0引言
组织细胞性坏死性淋巴结炎(KikuchiFujimoto Disease, KFD)由Kikuchi和Fujimoto于1970年首先报道. 是一种主要累及淋巴结的自限性全身性疾病，世界各地均有报道，但以东方青年女性多见. 其病理特征主要为淋巴组织散在灶片状坏死，伴有大量组织细胞浸润，易与淋巴瘤混淆，病因尚不清楚. 曾有研究者发现在系统性红斑狼疮和嗜血细胞综合症伴发KFD样淋巴结改变患者中检测到人微小病毒B19［1-2］，但对于B19病毒与原发性KFD的关系，仅Chiu等［3］用免疫组化的方法检测了10例KFD患者的淋巴结活检标本，但未得到阳性结果. 在此，我们观察了人微小病毒B19基因组DNA及病毒衣壳蛋白在原发性KFD中的表达情况，以探讨二者的关系.
1材料和方法
材料KFD组织活检标本32(男11,女21)例来源于第四军医大学西京医院及唐都医院病理科，均经HE及CD68免疫化学染色并结合临床表现确诊. 患者年龄10～69(中位年龄25)岁. 31例(97%)来源于颈部淋巴结；16例(50%)发病时有发热. 所有患者均无皮疹、关节炎等症状，自身抗体阴性. 同时，以13例乳腺癌或胃癌患者未转移的淋巴结做为标本对照. 所有活检标本均经常规固定，石蜡包埋. 实验过程及结果观察均采用双盲法. 地高辛标记及检测试剂盒； Taq DNA聚合酶和dNTP；鼠抗微小病毒B19衣壳蛋白VP1/VP2 mAb；CD68 mAb；染色HistostainSAP试剂盒； 显色用NBT/BCIP.
图1组织细胞性坏死性淋巴结炎HE ×200
方法

探针的制备以PCR扩增所得173 bp大小的B19病毒基因组DNA片段(对应于病毒基因组序列的3400～3572 bp)，经测序验证后作为标记探针的模板. PCR引物依据文献［4］由上海生工生物工程合成，所用标记方法依据试剂盒说明书.
原位杂交操作方法依据说明书及文献［5］. 石蜡切片经二甲苯脱蜡，逐级乙醇脱水， mol/L盐酸酸化10 min， g/L蛋白酶K 37℃消化10 min.　mol/L PBS洗后逐级乙醇脱水，空气干燥. 预杂交30 min后每张切片加15 μL B19特异性探针，95℃变性10 min，聚冷10 min后于湿盒中42℃过夜. 逐级2×SSC, 1×SSC, ×SSC, ×SSC, ×SSC振洗. 封闭缓冲液37℃封闭30 min，加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体置37℃，3 h. Washing缓冲液振洗30 min，加入NBT/BCIP混合物避光显色. 观察到明确阳性信号后终止显色，脱水、透明、中性树胶封片. 以预杂交液和标记试剂盒所带标记上地高辛的质粒pBR328线性DNA做为阴性对照.
免疫组织化学组织片经梯度乙醇脱蜡至水，经3 mL/L过氧化氢―甲醇封闭内源性过氧化物酶、100 g/L BSA封闭非特异性结合位点后，加入B19特异性 mAb 4℃过夜. 第2日切片经37℃复温、PBS洗后加入生物素化二抗于37℃孵育20 min，PBS洗，加入碱性磷酸酶标记的抗生物素复合物，37℃孵育20 min，PBS洗后加入NBT/BCIP避光显色. 阳性信号出现后终止显色，脱水、透明、中性树胶封片. 染色中以相同Ig浓度抗人神经胶质酸性蛋白抗体(与B19抗体同属IgG G1亚类)和PBS分别做替换对照和阴性对照.

原位杂交-免疫组化双标记免疫组化依上述方法进行. 100 g/L BSA封闭非特异性结合位点后，高压修复抗原表位. 加入抗人组织细胞单抗表面标记CD68 mAb于37℃孵育2 h，PBS洗，加入生物素化二抗，37℃孵育20 min，PBS洗，加入标记过氧化物酶标记的抗生物素复合物，37℃孵育20 min，PBS洗后加入DAB显色. 阳性信号出现后终止显色，进入原位杂交染色程序，方法同前述. 满意阳性信号出现后切片脱水、透明、中性树胶封片.统计学处理：B19病毒原位杂交及免疫组化阳性例数在两组中分别以阳性率表示，两组之间差别做χ2检验，用SPSS 软件完成. 表示差别有统计学意义.
2结果
原位杂交B19特异性探针原位杂交阳性信号位于细胞核中，阳性细胞主要分布于滤泡间区，在坏死区及生发中心只有少量散在阳性细胞(图2).
图2组织细胞性坏死性淋巴结炎B19特异性探针原位杂交NBT/BCIP ×400
免疫组织化学病毒蛋白既存在于胞质，也存在于胞核中，且在所有阳性组织中均可见到此种分布，但在某一阳性病例中以胞质或胞核中的一种分布为主(图3).
原位杂交-免疫组化双标记大量B19特异性探针杂交阳性细胞CD68抗体染色阴性，只有少数组织细胞原位杂交信号阳性(图4). 表明B19感染细胞主要为淋巴细胞，少量为组织细胞. 经原位杂交和免疫组化检出的KFD组B19病毒基因组DNA和病毒蛋白阳性率见表1，经χ2检验分析两组差别明显()，即KFD组人微小病毒B19感染率明显高于对照组.阳性信号在胞核(粗箭头)和胞质(细箭头)中均可看到，但本例以胞核为主.图3B19特异性抗体免疫组化染色结果NBT/BCIP ×400一个组织细胞(灰粗箭头)和数个淋巴细胞(细箭头)B19病毒DNA阳性，
　　大量组织细胞(黑粗箭头)则为阴性.图4组织细胞性坏死性淋巴结炎中B19原位杂交-CD68免疫组化染色双染结果NBT/BCIP及DAB ×400
表1原位杂交及免疫组化检测B19病毒阳性率
3讨论
人微小病毒B19基因组全长5596 bp，主要编码3个蛋白：衣壳蛋白VP1，VP1及非结构蛋白NS1.研究［6］发现B19可以引起第五病(erythema infectiosum)、关节炎、胎儿水肿、一过性再生障碍性贫血、心肌炎等疾病. Meyer等［1］在3例伴发于系统性红斑狼疮的KFD患者血清中发现了B19特异性抗体IgM和IgG. 此后， Yufu等［2］先后在噬血细胞综合征患者血清及淋巴结活检组织中发现了B19抗体、B19基因组DNA和病毒蛋白，这些患者的淋巴结活检发现类似于KFD的特征. 但都继发或伴发于其它疾病或疾病过程，并不是真正的原发性KFD. Chiu等［3］用免疫组化的方法检测了10例原发性KFD患者的淋巴结活检标本，未得到阳性结果，不过他当时的研究并不是以B19病毒为主，而且使用的是B19多抗. 我们的结果发现B19病毒基因组DNA及病毒蛋白在KFD患者淋巴结中的阳性率远高于对照组.表明在KFD组中人微小病毒B19的感染率远高于对照组.
经典的B19感染细胞主要为红系幼稚细胞. 我们通过原位杂交―免疫组化双重染色的方法初步揭示了在KFD中B19感染细胞主要为淋巴细胞，少数为组织细胞，这与近年发现淋巴细胞和组织细胞具有B19受体相一致［7］. 研究［8］发现，B19病毒感染可以介导抗双链DNA抗体和抗淋巴细胞自身抗体的出现. B19病毒的非结构蛋白NS1除了直接引起细胞凋亡外，还可以引起IL1，IL2，IL6，TNFα，IFNγ等炎症因子的分泌，而这些炎症因子可以在B19病毒相关性关节炎、自身免疫状态异常患者中引起炎症和细胞损伤［9］ .而B19感染所引起的促炎症因子分泌很可能就是导致KFD细胞坏死的原凶. 这不但有助于更进一步研究KFD的发病机制，而且为临床治疗及预防KFD提供了新的思路.
【参考文献】
［1］ Meyer O, Kahn MF, Grossin M, et al. Parvovirus B19 infection can induce histiocytic necrotizing lymphadenitis (Kikuchis disease) associated with systemic lupus erythematosus ［J］. Lupus, 1991,1(1):37-41.
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［3］ Chiu CF, Chow KC, Lin TY, et al. Virus infection in patients with histiocytic necrotizing lymphadenitis in Taiwan. Detection of EpsteinBarr virus, type I human Tcell lymphotropic virus, and parvovirus B19 ［J］. Am J Clin Pathol, 2000,113(6):774-781.
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