级研究生双向与光合实验样本.doc

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级研究生《植物科学实验技术》
双向电泳技术( 524 lab)
一、 实验目的:
了解蛋白质组学研究中的基本实验设计思路, 掌握蛋白质组双向电泳实验流程及相关软件分析。
二、 材料与试剂
材料: ①叶片( 墨兰、 石斛) ②花芽( 春石斛、 蝴蝶兰) ③蝴蝶兰花瓣( 白色、 红色) ④蝴蝶兰花苞
仪器: 聚焦仪, 天平, 电子秤, 适用于2ml、 10ml、 50ml离心管的高速离心机, PH计, 磁力搅拌器, 低温冰箱, 真空泵, 紫外分光光度计, 水浴锅等
试剂: 三氯乙酸( TCA) , 丙酮, β-巯基乙醇, Tris-base, 牛血清蛋白, 考马斯亮蓝G-250, 无水乙醇, 尿素( Urea) , 硫脲( Thiourea) ,CHAPS, DTT, 碘乙酰胺IAA, IPG buffer, PH3-10,IPG预制胶条( 7cm, PH3-10) , 丙烯酰胺, 甲叉双丙烯酰胺, SDS, 过硫酸铵(Ap),甘氨酸Gly, 硫酸铵, 甲醇, 溴酚蓝, 超纯水, 液氮,正磷酸等
器皿: 研钵, 10ml、 50ml、 100ml、 500ml容量瓶, 10ml、 500ml烧杯, 1.5ml、 50ml离心管, 50ml量筒, 1ml、 5ml、 2.5ul、 10ul、 20ul、 100ul微量移液器, 100ml棕色瓶, 冰盒, 滤纸, 玻璃棒, 记号笔, 布氏漏斗, 试管等
三、 实验流程
I 样品制备
A: 蛋白质制备方法( 全程低温, 操作尽量快、 准; 双向电泳最重要、 最基础步骤)

A-1 TCA/丙酮沉淀法 —— 墨兰、 石斛叶片
1. 称取0.3克左右样品, 在预冷的研钵中, 液氮研磨成粉
2. 粉末转移至10ml离心管中, 加入6-8ml 10%TCA/丙酮, -20℃沉淀过夜( 至少2小时) , 震荡几次
3. 取沉淀过夜的样品重量平衡, 离心( 13200rpm、 4℃、 30min) , 弃上清
4. 向沉淀中加入6-8ml冷丙酮, 混匀并进行重量平衡, -20℃沉淀20min,离心( 13200rpm、 4℃、 30min) 弃上清。( 此过程重复三次)
5. 向沉淀中加6-8ml 80%冷丙酮混匀并进行天平平衡, -20℃沉淀20min,然后离心( 13200rpm、 4℃、 30min) , 弃上清。( 此过程重复两次)
6. 转移沉淀到1.5ml离心管中, 加1ml 冷丙酮洗涤、 沉淀两次( 离心0.5min)
7. 真空冰浴抽滤, 干燥沉淀至干粉, -80℃低温保存。
(补充: 醋酸铵/甲醇沉淀法:基本步骤同TCA/丙酮沉淀法, 只是第2步加入的是0.1M醋酸铵/甲醇)

A-2酚抽提法 —— 石斛、 蝴蝶兰花芽
1. 称取0.3克左右样品, 在预冷的研钵中, 液氮研磨成粉
2. 粉末转移至10ml离心管中, 加入酚抽提液与水饱和酚混匀, 离心( 13200rpm、 4℃、 20min)
3. 吸取上层酚相, 加入0.1M醋酸铵甲醇( ①液) , 剩余下层水相, 加入Tris饱和酚混匀, 离心( 13200rpm、 15℃、 20min)
4. 吸取上层酚相, 加入0.1M醋酸铵甲醇( ②液) , 下层水相及杂质丢弃, ①和②-20℃沉淀过夜( 4h以上)
5. 取沉淀过夜的样品重量平衡, 离心( 13200rpm、 4℃、 30min) , 倒掉上清, 加入6-8ml冷丙酮混匀, -20℃沉淀30min,离心( 13200rpm、 4℃、 20min) , 弃上清。
6. 向沉淀中加6-8ml 80%冷丙酮混匀, -20℃沉淀20min,然后离心( 13200rpm、 4℃、 30min) , 弃上清。
7. 转移沉淀到1.5ml离心管中, 加1ml 冷丙酮洗涤、 离心沉淀两次( 离心0.5min)
8. 真空冰浴抽滤, 干燥沉淀至干粉, -80℃低温保存。

A-3 Tris-HCl提取缓冲液/醋酸铵-甲醇提取法——蝴蝶兰花瓣( 白色、 红色) :
1. 称取1.0 g花瓣, 加入少许PVP, 液氮研磨
2. 粉末转移至10ml离心管中, 加5倍体积的 Tris-HCl提取缓冲液和少量的PMSF, 摇匀, 冰上悬
浮10 min, 离心( 13200rpm、 4℃、 15min )
3. 取上清液加入预冷的5倍体积的0.1M 醋酸铵甲醇, -20℃条件下沉淀过夜。
4. 取沉淀过夜的样品重量平衡, 沉淀加入10ml 0.1M醋酸铵甲醇溶液洗涤, 离心( 13200rpm、 4℃、 15min )
弃上清。该步骤重复3次。
5. 沉淀加入10ml预冷80%丙酮洗涤, 离心( 13200rpm、 4℃、 15min ) 弃上清。该步骤重复2次
6. 沉淀分装到1.5ml离心管中, 加1ml 冷丙酮洗涤、 离心沉淀两次( 离心0.5min)
7. 真空冰浴抽滤, 干燥沉淀至干粉,-80℃低温保存。
A-4 蝴蝶兰花苞( 两种方法: 酚抽提法、 Tris-HCl提取缓冲液/醋酸铵-甲醇提取法) 步骤见A-2和A-3

试剂:
TCA—丙酮: 10% TCA, 0.07%ß-巯基乙醇, 以丙酮为溶剂。置于-20℃冰箱保存。
冷丙酮 : 含有0.07%ß-巯基乙醇的丙酮, 置于-20℃冰箱保存。
80%冷丙酮: 80%丙酮, 0.07%ß-巯基乙醇, 用双蒸水定容。置于-20℃冰箱保存。
0.1M醋酸铵-甲醇: 醋酸铵0.7708g, 甲醇定容。Tris-HCl提取缓冲液
酚抽提液: 蔗糖23.96g、 氯化钾0.746g、 EDTA 1.461g、 Tris-base 6.057g、 HCl0.25ml, 双蒸水定容。( ß-巯基乙醇2%( v/v) 现用现加) 。置于4℃冰箱保存。
Tris-HCl提取缓冲液: 0.1M Tris-HCl( pH 8.0) , 5 %( w/v) 蔗糖, 2%( w/v) SDS, 5%( v/v) β-巯基乙醇, 2mM PMSF( 4℃保存)

B: Brandford 法定量蛋白
1) 考马斯亮蓝G-250试剂:
50mg考马斯亮蓝G-250溶于25ml 90％乙醇, 加入50 ml 85％正磷酸, 用双蒸水定容到500ml。
2) 标准蛋白溶液: 称取10mg牛血清白蛋白定容到100ml, 得到100μg/ml的标准蛋白溶液。1ml标准溶液加5ml考马斯亮蓝G-250试剂, 反应2min后测定595nm处吸光值。

0
1
2
3
4
5
6
100μg/ml的标准蛋白溶液(ml)
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水(ml)
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白含量( μg)
0
10
20
40
60
80
100
A 595

e.g．测得数据处理后, 得线性标准曲线为 y=0.0074 x + 0.0164 ( R2=0.997, 一般R2＞0.995定量较好)

3) 样品蛋白质含量测定
10ul蛋白质样品加水稀释到1ml, 加5ml考马斯亮蓝G-250试剂, 反应2min后测定595nm处吸光值。根据标准曲线方程计算蛋白质含量。
II 双向电泳
第一部分 第一向等电聚焦( IEF)

1、 称取15mg蛋白质干粉加入约300ul( 1: 20) 水化液( 根据方法适当调整干粉与水化液比例) 混匀, 30℃( 绝对不能超过33℃, 防止蛋白氨甲酰化) 水浴至少1h, 然后离心( 13200rpm、 15℃、 40min, 吸取上清( 计体积) 。
蛋白质浓度测定: 吸取10ul样品测定595nm吸光值, 根据标准曲线计算蛋白质浓度
2、 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条( 7cm、 pH3-10 NL) , 室温中放置10分钟。
3、 根据测定的蛋白质浓度, 吸取适量样品( 7cm胶条蛋白上样量为200-300ug) , 用水化液补足180μl上样。
4、 沿着聚焦盘槽的边缘自左而右线性加入样品。在聚焦盘或水化盘两端各1cm左右不要加样, 中间的样品液一定要连贯。注意: 不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的吸收和分布。
5、 用镊子去除IPG胶条上的保护层。将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液, 胶条的正极( 标有+) 对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触, 不使胶条下面的溶液产生气泡。(Bio-rad/GE标准胶条槽)
6、 在每根胶条上覆盖约1ml矿物油, 防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油, 沿着胶条, 使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
7、 对好正、 负极, 盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中, 设置等电聚焦程序。
7cm胶条
水化 50V 20℃ 12 h 主动水化
S1 100V 快速 4 h 除盐
S2 1000V 线性 1 h 除盐
S3 4000V 线性 1 h 升压
S4 4000V 快速 2万VH 聚焦
S5 500V 快速 99 h 保持
选择所放置的胶条数。( 1根)
设置每根胶条的极限电流。( 50mA/根)
设置等电聚焦时的温度。( 20℃)
补充: GE Manifold 胶条槽
胶条被动水化( 水化盘, 水化步骤同主动水化) , 水化结束后的IPG胶条胶面朝上置于Manifold 胶条槽中, 加滤纸盐桥, 胶条的正极( 标有+) 对应于聚焦盘的正极, 活动电极压在滤纸并卡紧。设置电压程序, 同上。
8、 聚焦结束的胶条, 立即进行平衡、 第二向SDS-PAGE电泳, 否则将胶条置于样品水化盘中, -20℃冰箱保存。
试剂:
水化液(10ml): 尿素( Urea) 8M 4. 8g; 硫脲( Thiourea) 2M 1. 52g; CHAPS 4%( v/v) 0.4g; 0.001%( w/v) 溴酚蓝; DTT 10mM( 10ul 1M DTT母液) ;
IEF上样前加入IPG buffer( 0.5%(v/v)PH 3-10NL) 和溴酚蓝

第二部分 胶条平衡

1．在桌上先放置干的厚滤纸, 聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用双蒸水浸湿, 然后直接置于胶条上, 轻轻吸去胶条上的矿物油及多余样品。以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
2. 将胶条胶面朝上转移至平衡盘中, 加入2.5ml平衡缓冲液I。将样品平衡盘放在水平摇床上平衡15分钟( 计时器计时) 。
3. 向另一个槽内加入2.5ml胶条平衡缓冲液II, 待第一次平衡结束后, 胶条胶面朝上转移至平衡缓冲液II中, 继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
4．第二次平衡期间, 将低熔点琼脂糖及Marker进行加热6min左右。

试剂:
平衡缓冲液: 50mM Tris-Hcl (PH8.8); 6m M 尿素; 30％甘油( v/v) ; 2％ SDS 0.002%溴酚蓝
平衡液Ⅰ: + 1% DTT (0.025g/2.5ml平衡缓冲液) 还原试剂 (将S–S键转化为SH)
平衡液Ⅱ: + 2.5% IAA (0.0625g/2.5ml平衡缓冲液) 烷基化试剂 (中和DTT, 使组氨酸和半胱氨酸烷基化)
第三部分 第二向 SDS-PAGE
1、 灌胶
配制10ml 12%的丙烯酰胺凝胶, 将溶液注入玻璃板夹层中, 上部留约0.5cm的空间, 用无水乙醇封面, 保持胶面平整。聚合约1h。
12% PAGE胶
mL
水
3.2
30%丙烯酰胺溶液
4.0
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
2.6
10% SDS
0.1
10%过硫酸氨( Aps)
0.1
TEMED
0.004
2、 倒去SDS-PAGE凝胶上方玻璃板间多余的液体, 用滤纸吸干, 将处理好的第二向凝胶放在桌面上, 长玻璃板在下, 短玻璃板朝上, 凝胶的顶部对着自己。
3、 第二次平衡结束后, 取出胶条用滤纸吸取多余的平衡液, 并完全浸没在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
4、 用镊子轻轻地将胶条向下推, 使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触, 加入已加热好的低熔点琼脂, 不要在胶条下方产生气泡。
5、 待低熔点琼脂糖凝胶完全凝固后, 将凝胶转移到电泳槽中, 在电泳槽加入电泳缓冲液后( 防止产生气泡) , 接通电源。7cm胶板12％连续15mA 10min; 30mA 1h 30min
7、 电泳结束后, 轻轻撬开两层玻璃, 取出凝胶, 并切角以作记号。
8、 改良考马斯亮蓝染色
参照Candiano等的方法略作改动, 具体步骤为:
( 1) 清洗: 用清水洗涤胶5min两次
( 2) 染色: 考马斯亮蓝G-250染色过夜;
( 3) 脱色: 双蒸水清洗2次, 双蒸水漂洗变浅至背景为无色;
试剂:
30% 聚丙烯酰胺贮液( 30%Acr-Bis)
丙烯酰胺 30g; 甲叉-双丙烯酰胺0.8g; 用双蒸水定容至100ml; 滤膜过滤后, 棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/L Tris碱 pH8.8
Tris碱 18.15g; 双蒸水 80ml
用1mol/L HCl调pH至8.8, 加双蒸水定容至100ml。滤膜过滤后, 棕色瓶4℃冰箱保存。
10% SDS 10g SDS溶于100ml双蒸水, 滤膜过滤后, 棕色瓶常温冰箱保存。
10% Ap(现用现配): 10mg Ap溶于100ul
1×电泳缓冲液( 25mM Tris, 192mM glycine, 0.1% SDS)
Tris碱 3.03g; 甘氨酸 14.4g; SDS 1g; 双蒸水 1L; 混匀后, 室温保存。
染色液
0.12％考马斯亮蓝G-250＋10％硫酸铵＋10％正磷酸＋20％甲醇( 后再加25%甲醇)

第四部分 图象扫描及分析

1. 打开扫描仪, 再打开计算机; 将凝胶至于扫描仪上, 用纯水小心湿润, 使胶与扫描仪的玻璃板之间没有气泡, 并用纸巾小心吸干凝胶周围的水分, 盖上上盖, 准备进行扫描。
2. 预览确定扫描范围, 调整扫描范围和扫描窗口大小, 进行扫描, 保存( 一般是TIFF文件格式) 。
3. 扫描结束后, 先用纸巾小心吸干大部分水分, 再用擦镜纸小心的擦拭镜面。盖好盖子, 关闭计算机和扫描仪电源。
4. 用PDQuest分析软件分析, 具体参照PDQuest™ 2-DAnalysis Software教程

Ⅲ 单向SDS-PAGE电泳
1. 样品复溶:
称取10mg蛋白质干粉加入约300ul( 1: 30) 样品缓冲液混匀, 85℃水浴5min, 然后13200rpm 15℃ 20min, 吸取上清( 计体积) 。
2. 灌胶:
配制8ml丙烯酰胺分离胶和3ml浓缩胶, 先将分离胶灌入玻璃板中, 凝结40min, 然后将浓缩胶灌入并插入梳子, 凝结30min
3. 点样:
将单向电泳仪组装好, 向内槽加上电泳缓冲液, 小心拔出梳子, 定量上样( 每孔10ul液体) , 进行电泳
电泳程序: 15mA 10min 30mA 1h20min( 视电泳速度调整)
4. 拆板: 电泳结束后, 轻轻撬开两层玻璃, 取出凝胶, 并切角以作记号。
5. 染色:
改良考马斯亮蓝G-250
参照Candiano等的方法略作改动, 具体步骤为:
( 1) 清洗: 用清水洗涤胶5min两次
( 2) 染色: 考马斯亮蓝G-250染色过夜;
( 3) 脱色: 双蒸水清洗2次, 双蒸水漂洗变浅至背景为无色;
试剂:
样品缓冲液: 1.0M Tris-Hcl( PH6.8) 1.6ml; 10%SDS 4ml; 87%甘油 2.5ml; 溴酚蓝0.4ml; β-ME 1ml( 先不加) 超纯水定容到20ml 。4℃长期保存。
带分离胶的凝胶配方:
试剂
12%分离胶( 共8ml)
3%浓缩胶( 3ml)
双蒸水
2.56
2.11ml
Acr-Bis
3.20
0.51
1.5mol/LTris-HClpH8.8
2.08
——
1.0mol/LTris-HClpH6.8
——
0.38
10% SDS
0.08
0.03
10% AP
0.08
0.03
TEMED
0.008
0.003

四: 研究生分组和时间安排
1. 参加《植物科学实验技术》的研究生分为四个大组( 大家根据课程安排及自身情况自行调整) 。
2. 以大组为单位, 进行双向电泳以及凝胶染色和图像分析。
3. 每位同学撰写一份实验报告, 本学期结束后上交, 便于成绩录入。
4. 三天: ①制备样品: 晚上、 第二天上午 ② 一向、 单向: 上午、 晚上; 二向: 第二天晚上 ③ 图像扫描

实验 LI-6400便携式光合仪测定植物(兜兰)的光合日变化

一 实验目的
1了解LI-6400光合测量系统的工作原理, 经过本实验掌握其基本操作。
2 经过测定植物白天各时段光合速率的变化, 绘制光合日变化曲线并分析。
二 实验原理
LI-6400是一个开放系统, 即光合和蒸腾的测量基于流动于叶室内气流中CO2、 H2O的变化量。LI-6400领先于传统开放系统的地方在于它将气体分析器安装于传感器头上。这样节省了气流到达传感器的时间, 检测速度的改进不是依赖于气流计( 传统系统往往这样) ,而且严格准确地反映出叶片的变化。光照的突然变化会导致光合速率的突然变化, 这会由CO2浓度的变化来检测到。
三 实验材料
第一组:肉饼、 第二组:红魔帝、 第三组:白魔帝
四 实验方法
按照LI-6400光合测量系统的实验说明, 测定自然条件下植物材料的光合速率, 观察光合速率的变化, 待数值稳定后开始记录。
具体步骤
1 使用普通叶室, 连接好LI-6400便携式光合仪, 打开电源预热20min。
2 在OPEN主菜单下的”Calib Menu”下, 选择F3对仪器的Flow、 CO2、 H2O等进行零点校正。注意校正CO2、 H2O零点时, 应该关闭叶室而且保持叶室中不能夹入叶片, 而且要用新鲜的碱石灰和干燥剂。
3 经过OPEN主界面的F4( New Msments) 菜单打开一个保存测量数据的文件, 输入保存测量数据的文件名, 并添加标记, 以便于数据的输出和分析。
4 设置测量条件( 光强 lamp off、 CO2浓度 mixer off、 气体流速 500、 叶面积大小 6、 气孔比率 2) , 自然条件下测定不需设置光强与CO2。设置完成后, 观察参比室与样本室读数差异, 若超出试验误差允许范围时需要进行匹配( Match), 测量过程中仪器也可自动匹配。
5 夹入叶片, 叶片适应, 数值稳定后进行记录( 按Log键, 系统就会把整套数据保存起来) 。换叶片重复此步。
6 完成所有记录后, 关闭文件( Close file)。
7 用RS-232数据线连接电脑和LI-6400, 按esc退回主界面, 按F5( Utility Menu) 按上下箭头选择”File Exchange Mode”, 在电脑上预先安装Sim FX软件, 双击打开LI6400FileEx, 点击File, 选择Prefs, 选择Com端口, 按Connect, 连接成功后, 选择文件传输到指定位置。
8 关机。按esc, 退回主界面, 关闭电源。
9 把化学管旋钮旋至中间松弛状态; 旋转叶室调节螺丝, 保持叶室处于打开状态。
五 实验结果
六 结果分析