治疗性单抗研究进展与抗体产业关键技术模板.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。
治疗性单抗研究进展与抗体产业关键技术
发布时间: -6-21
抗体作为机体免疫应答的效应分子, 能够识别、 中和或清除诱发疾病的抗原。抗体的"可变区"( Fab) 可特异性的结合抗原或靶细胞; 抗体的"恒定区" ( Fc) 介导多种细胞效应功能( CDC、 ADCC等) 。另外, Fc端与FcRn的结合, 使得抗体分子在体内的半衰期长达十至二十天。以上抗体的分子结构与 生物功能保证了其作为治疗性蛋的药用疗效。98
截止 底, 欧美市场已有总计三十余种治疗性抗体上市销售( 见图1) 。以上抗体药物已经在免疫性疾病[1]、 癌症[2]等治疗领域取得巨大成功。而 从抗体药物的研发线来看, 已经有三百余种单抗药物进入临床研究阶段[3]。抗体药物研制的成功率( 20%) 远远高于传统小分子化学药( 11%) [4]。所 以, 抗体药物已经成为, 而且未来仍将是制药行业发展的主要方向[5]。
1抗体技术与抗体药物的发展进程
1.1 抗体技术的发展进程
抗体在临床上的治疗性应用, 始于1888年Emile Roux使用"多克隆抗体"治愈白喉病患者。1897年Paul Ehrlich's 提出了"魔术子弹"( magic bullet) 的假说: 即利用抗体进行"靶向治疗"。利用抗原免疫动物能够快速获得含有多克隆抗体的"抗血清"。可是由于多克隆抗体本质上是针对抗原不同 表位的单克隆抗体混合物, 其质量并不均一, 加之受免疫动物的制备路线所限, 多克隆抗体在临床上的应用并不多见; 上世纪七十年代, 利用小鼠B淋巴杂交瘤细 胞, 能够获得抗单个抗原决定簇的"单克隆抗体", 后者较多克隆抗体特异性高、 均一性好, 成本低廉, 为抗体技术的临床应用带来突破[6]。
上世纪八十年代, 美国Gentech公司申请了关于"重组抗体"制备的首个专利( "Cabilly patent"专利) , 即利用DNA重组技术, 将抗体重链、 轻链DNA同时导入宿主细胞, 后者合成并分泌具有生物活性的单克隆抗体。此后, 治疗性抗体的生 产真正进入到产业化阶段。另外, 基因工程抗体能够在基因水平对抗体分子进行切割、 拼接, 组装, 赋予抗体分子新的生物活性, 较"多克隆抗体""杂交瘤单抗" 更具应用前景。
1.2抗体药物的发展进程
1986年, 采用杂交瘤技术生产的"鼠源单抗"OKT3TM( muromonab) 成为上市的首个治疗性单抗。可是, 由于鼠源单抗严重的免疫原性( 人抗鼠抗) 问题。抗体药物在上市的首个十年间临床应用并不广泛。
此后, "嵌合抗体"技术保留鼠源Fab, 采用人源Fc段替代鼠源Fc端, 部分减轻了鼠源抗体的免疫原性。"CDR移植技术"又可将可变区的部分序列更换为 人源序列, 进一步的减轻嵌合抗体的免疫原性, 采用此技术的抗体药物称之为"人源化抗体"( humanized antibody) 。由于成功的降低了重组抗体的免疫原性, 上世纪九十年代末上市的诸多嵌合抗体和人源化抗体, 得以在临床上广泛应用。
"嵌合抗体"的人源程度可达66%, "人源化抗体"可达90-95%, 但仍不是真正意义上的"人源抗体"。上世纪八十年代发展起来的"体外展示技术"( 噬 菌体、 酵母菌、 核糖体展示等) , 经过构建大容量人源抗体文库, 可实现全人源抗体的体外筛选[7]( 如 上市Adalimumab) 。本世纪初兴起 的的"转基因鼠"技术( 如: HuMAb-MouseTM、 KM-MouseTM、 XenoMouseTM、 VelocImmuneTM、 等) , 在小鼠体内转入了人的抗体基因簇, 经抗原免疫后也产生全人源抗体[8]( 如 上市的Panitumumab) 。另外, 近年来出现"兔单抗"技术( 如RabMAbTM) , 较传统鼠源抗体亲和力强、 特异性高, 也是成为抗体药物设计的一种选择[9]。从当前以上市抗体的结构分析, 人源化抗体及全人源抗体已经成为抗体药物的主流[10]( 见图1) 。

注: 鼠源单抗: -omab ; 嵌合抗体: -ximab;; 人源化单抗: -zumab ; 人源单抗: -umab; 融合蛋白: -cept
图1 抗体技术与抗体药物发展历程( 数据截止至 12月)
Fig.1  The development progress of antibody technology and antibody drug (Date current as December  )
当前抗体药物开发的最新趋势体现在: 一是, 在原有药物靶点基础上, 利用"抗体工程"技术, 提高单抗药物的疗效[11]( 见图2) ; 二是, 构建抗体免疫连接 物、 抗体片段、 双特性抗体, 或新型结构的抗体药物。如: 上市的Soliris ( Eculizumab) , 其Fc端为IG2/4的嵌合体[12]; 上市的"三特异性抗体"RemovabTM, 可变区可同时结合肿瘤靶点和 CD30受体。[1]

2 国内外抗体药物产业现状
2.1 国际上抗体产业现状
美国市场上的抗体药物成为生物技术药物销售额最大的类别。此后数年, 抗体药物的销售额均保持在6-8%的增长率。 美国市场的单抗药物 销售额为185亿美元, 世界范围内单抗药物销售额总计已达400多亿美元, 约是整个生物制药市场份额的36%[13]。在已上市的单抗药物中, 销售额排名 前五位的单抗品种, 为整个抗体药物市场贡献着82%的市场份额。因此, 抗体药物的品种上有所谓"Big 5"之说( 即: bevacizumab、 trastuzumab 、 adalimumab、 infliximab, rituximab) 。据预测, adalimumab和bevacizumab将成为世界上销 售量最大的药物品种[14]。
在国际制药行业, 一方面, 传统制药公司经过兼并建立其在抗体药物上的产品线, 如: 强生收购Centocor, 罗氏收购Immunex、 Genentech 等; 另一方面大型药企经过组建自己的抗体药物研发平台, 以保持其在单抗药物开发上的技术优势。如Seattle Genetics重点发展"抗体免疫连接物", [15]。GSK和Boehringer Ingelheim经过并购, 建立"双特异性抗体"药物研发平台[16]。
随着抗体原研药物相关专利的到期, 欧盟、 美国开始考虑审批抗体仿制药。 11 月, EMEA也出台了《生物仿制药的草案》, 2月FDA也颁布了《生物仿制药指导原则草案》, 两者均开始建立以"生物相似度"为核心的生物仿制 药审批流程, 这些都为抗体仿制药的审批铺平道路。而在政策相对宽松的亚洲, 中国、 印度、 韩国均已有抗体仿制药上市。印度Dr.Reddy公司的 RedituxTM售价仅为原研药物RituxanTM成本的十分之一[17]。中国市场上也出现仿制药益赛普TM、 强克TM与原研药物EnbrelTM竞争的局面。
2.2 中国抗体产业发展现状
中国的抗体药物产业尚处起步阶段, 近十年间国内先后涌现出后中信国健、 百泰生物、 成都弘康、 上海赛金等多家专门从事单抗药物生产的企业。同时, 许多传统制 药企业( 哈药、 海正、 华药、 先声等) 也开始涉足抗体药物领域。特别是近两年, 服务抗体药物开发的CRO/CMO公司( 药明康德、 义翘神州、 中美奥达等) 开 始出现。标志着新兴的抗体产业在中国已初现雏形。
可是, 无论从上市品种, 还是从行业产能, 技术水平等方面分析, 中国的抗体产业的发展尚处于起步阶段。当前中国的上市抗体品种中( 见表一) , 国外进口单抗占 据多数, 中国市场上唯一全人源抗体( Adalimumab) 为国外公司( Abbott) 进口, 上述"Big 5"单抗药物在国内均已上市; 中国自主研发的六种抗体药物, 以鼠源、 嵌合、 人源化为主, 多集中在少数靶点上( TNF、 EGFR, CD25等) 。这就意味着 相同临床适应症上, 将面临国内外不同厂家的品种竞争。
Table 1 The analysis of approved therapeutic antibody in China
表一 中国上市抗体药物品种分析[14]

商品名
靶点
类型
主要适应症
开发厂家
备注
利卡汀
CD147
鼠源
肝癌
成都华神
自主靶点HAb18G/CD147
唯美生
核蛋白
嵌合
实体瘤
上海美恩

类克( Infliximab)
TNF
嵌合
银屑病
J&J
全球销量2076百万美元
修美乐( Adalimumab)
TNF
人源
类风湿
Abbott
全球销量9265百万美元
强克
TNF
融合蛋白
类风湿
上海赛金
仿Etanercept
益赛普
TNF
融合蛋白
类风湿
中信国健
仿Etanercept
爱必妥(Cetuximab)
EGFR
嵌合
直肠癌
Merck GaA
市场销量1781 万美元
泰欣生
EGFR
人源化
鼻咽癌
百泰生物
同靶点已有嵌合/人源抗体
赛尼哌(Daclizumab)
CD25
人源化
免疫抑制
罗氏
全球销量26百万美元
健尼哌
CD25
人源化
免疫抑制
中信国健
仿Daclizumab
美罗华( Rituximab)
CD20
嵌合
淋巴瘤
罗氏
全球销量6449百万美元
安维汀( bevacizumab)
VEGF
人源化
直肠癌
罗氏
全球销量5543百万美元
赫赛汀(trastuzumab)
HER2
人源化
乳腺癌
罗氏
市场销量5859万美元
舒莱(Basiliximab)
嵌合
CD25
免疫抑制
诺华

更为重要是, 治疗性抗体作为大剂量重组蛋白药物。一个年销售额过亿美元的单抗药物, 往往需要年产百公斤级重组蛋白的产能做支撑。行业的技术水平与产能规模 将直接影响上市抗体的成本与盈利。中国抗体行业普遍存在着细胞系表示水平低, 培养规模小、 纯化能力不够等技术问题[18] [19, 20]。以上诸多"产业化关键技术"限制了中国抗体产业的产能规模, 制约了行业的发展进程( 见图2) 。

3 抗体产业关键技术
当前国际上抗体药物的生产成本一般控制在500美元/g以下。为此, 相应的产业化技术水平要达到以下指标: 细胞系表示能力>20pcd( pg /cell/day) , 大规模培养工艺抗体表示水平在1-5g/L, 下游纯化能力在50~100kg/batch, 纯化收率在70%以上[21] [22]。
3.1工程细胞系的构建
能够正确表示重组抗体的细胞系, 还需具备"生长能力强, 表示水平高、 遗传稳定性等"特性, 才能成为具有产业化价值的"工程细胞系"[23]。国内当前抗体表示水平普遍偏低( <1g/L) , 其根本原因在于细胞系生产能力的不足( ＜20pcd) 。
在宿主细胞的选择上, 除了少数"鼠源抗体"仍由骨髓瘤细胞( NS0、 sp2/0) 生产外, 绝大多数抗体药物均由CHO细胞生产。近年来, Crucell公 司开发的人视网膜细胞系PER.C6 TM, 借助病毒载体能够实现重组抗体的高表示; Merck公司开发的酵母GlycoFi TM, 具备了抗体的特异性糖基化修饰能力[23]。
宿主细胞的遗传改造主要集中在借助于"细胞工程"技术提高细胞的生长能力和表示水平。如: 经过导入抗凋亡蛋白基因( bcl-2、 bcl-xl) , 使宿主细 胞具有更强的生长能力[24]; 经过构建"自分泌细胞"表示生长因子, 使宿主细胞更适合无血清培养; 经过过度表示二硫键异构酶及相关分子伴侣 ( Bip/GRP78, ERp57) , 提高宿主细胞对异源蛋白的折叠、 分泌能力, 等等。[25]
业内在细胞构建中多使用的"基因共扩增体系"( 如: DHFR/CHO DG44, GS/CHOK1) , 在基于此原理的重组细胞筛选过程中, 易出现目的基因拷贝丢失、 克隆间差异性差等问题, 为此可采用了"弱化筛选基因"、 "双 筛选基因" [26] [27]等多种改良策略。另外, 已经出现多种商品化载体功能元件, 能够克服载体"随机整合"时的"位置效应", 如: 强迫目的基因表示的侧翼元件 STARTM、 UCOEsTM、 MARsTM等; 用于目的基因"定点整合"的Flp‐InTM技术, 以及源自逆转录病毒的新型载体GPExTM等[28, 29]。
在"克隆筛选"环节, 传统的"有限稀释法"正在被流式细胞仪自动分选或高通量筛选设备( 如 clonePixTM, CellCelectorTM, CelloTM) 所代替[30]。另外, 工程细胞系的筛选策略, 也由单一以表示水平为依据, 也开始 转向综合评价细胞的生长能力[31] [32]、 生产能力、 产物质量[33]等多方面因素。
3.2细胞大规模培养工艺开发
当前, 国际上重组抗体的制备主要采用动物细胞培养工艺, 其容积产率一般可达3-5g/L  [27]( 最高可达13g/L[34]) 。大型制药企业的培养规模超过二十万升( 如: Amgen公司200,000L, Genentech 公司250,000L等) [21], 国内重组抗体生产水平低于1g/L, 流加培养规模不超过3,000L( 中信国健) , 灌注培养规模不超过( 500L) [18, 19]。
动物细胞用培养基逐渐由"无血清培养基"或"无动物来源培养基"转向"化学明确培养基" [35]。在培养基优化策略上, 除了传统的"组分滴定"、 "培养基混合"、 "消耗成分分析", "化学计量法"外[36], 当前更多的倾向于综合上述方法优 点的"理性培养基优化[37]"和"系统培养优化" [38]。另外, 借助迷你反应器( BioLectorTM、 SimCellTM、 Micro-24TM,ambrTM等) , 可实现高通量实验设计 [39]。
流加培养模式是当前重组抗体生产的主流方式, 其配套反应器多为搅拌罐和气升罐。近年来兴起的一次性反应器( waveTM、 Hyclone S.U.BTM等) 多用于扩增种子细胞或制备小规模样品。流加培养存在营养物质消耗、 代谢废物积累, 以及产品质量不稳定等问题, 因此其工艺优化集中在基础 培养基、 流加培养基以及流加策略上[40] [41] [42]。
灌注培养模式下, 细胞密度、 蛋白产量可较流加模式提高数倍[43, 44]。可是该工艺需使用细胞截留需特殊装置( 如旋转滤器、 倾斜沉降装置、 超声截留装置等) [45], 这就限制了其工艺的可操作性和放大性。灌注培养工艺 的优化策略为经过优化培养基组分, 降低灌流速度, 提高产物容积收率[46]。
细胞培养工艺中的物理条件( 温度、 pH、 渗透压等) 、 营养成分等均会重组抗体的质量( 聚体[47]、 糖基化[48], 电荷变异等[49] [50]) 影响。因此, 建立用于上市抗体生产的细胞培养工艺, 需要事先对其进行充分的"定性研究", 以确定各工艺参数的控制范围[51] [52]。
3.3大剂量重组蛋白纯化、 质控
随着产业上游培养规模( >10, 000L) 、 抗体产率( >5g/L) 的提高。下游纯化纯化环节的处理能力成为限制产能的"瓶颈"。另外, 纯化 环节介质的成本占据抗体药物的生产成本的70%以上。规模、 成本上的压力使得业内普遍认为: 未来下游纯化将是制约抗体行业扩大产能的主要因素[53]。
当前, 业内普遍采用一条抗体纯化生产线, 与数个发酵罐配套的设计方案。细胞收液一般采用微滤、 离心、 深层过滤等方法实现"固液分离", 经过"亲和色谱" ( protein A, protein G) 捕获抗体。然后再使用"精制色谱"( 阴离子交换色谱、 阳离子交换色谱、 疏水色谱等) 进一步去除宿主蛋白、 宿主DNA、 色谱配基等杂质。另外, FDA要 求整个纯化过程中需配有至少两步病毒灭活步骤。[54]
当前使用的亲和色谱( Prosep vATM、 MabSelectTM、 MabCaptureTM) , 其抗体捕获能力一般在15~50g/L。由于"柱色谱"不能无限制放大, 其产能放大存在 限制。新兴的一次性"膜色谱"技术, 如Q膜色谱技术( 如SingSep Q TM) 处理能力可达10~36kg/L [55], 具有潜在的应用价值。
抗体分子在整个制备工艺中存在多种降解途径, 如: 裂解、 二硫键错配、 甲硫氨酸氧化、 谷氨酸焦谷氨酸化、 天冬酰胺脱乙酰化、 天冬氨酸异构化等, 上述降解途径 会导致重组抗体在分子量、 纯度、 等电点、 糖基化等方面出现"异质性", 并最终影响抗体药物的临床疗效[56]。因此, 抗体药物的质控需根据临床疗效确定其 关键质量属性( Critical quality attribute) , 并据此确定抗体药物的工艺过程、 质量标准。
四 结语
中国于 已经成为世界第三大医药市场。国内对于抗体药物的市场需求巨大。生物制药产业也因此被列为中国十二五期间的战略性新兴产业。基于抗体抗体 的生物制药产业将是未来国家培育的重点行业。近年来, 国家先后建立"抗体药物国家工程中心"( 上海) 、 "抗体药物研制国家重点实验室"( 石家庄) 等国家级 重点实验室, 行业内部业内也自发形成"抗体产业联盟"等组织。市场需求的驱动、 产业政策的扶持, 都为中国抗体产业发展提供了良好的机遇。一旦在上述产业关 键技术上取得突破, 中国的抗体产业必将十年之内有一个跨跃式的发展! ( 来源: 生物谷)
[1]Chan AC, Carter PJ. Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation. Nat Rev Immunol, , 10(5): 301-316
[2]Weiner LM, Surana R, Wang S. Monoclonal antibodies: Versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol, , 10(5): 317-327
[3]Reichert JM. Which are the antibodies to watch in ? MAbs, , 5(1): 1-4
[4]Kozlowski S, Swann P. Current and future issues in the manufacturing and development of monoclonal antibodies. Adv Drug Deliv Rev, , 58(5-6): 707-722
[5]An Z. Monoclonal antibodies - a proven and rapidly expanding therapeutic modality for human diseases. Protein Cell, , 1(4): 319-330
[6]刘伯宁. 诺贝尔医学奖与免疫学的百年渊源. 自然杂志, , 34(4):167-171
Liu B N. The Nobel Prize highlights in immunologic history fro a century, Chinese journal of nature, , 34(4):167-171
[7]Bradbury AR, Sidhu S, Dubel S, et al. Beyond natural antibodies: The power of in vitro display technologies. Nat Biotechnol, , 29(3): 245-254
[8]Ni J. New technologies for the generation of human monoclonal antibody. Trends in Bio/Pharmaceutical Industry, , 5(3): 3-12
[9]Feng L, Wang X, Jin H. Rabbit monoclonal antibody: Potential application in cancer therapy. Am J Transl Res, , 3(3): 269-274
[10]Nelson AL, Dhimolea E, Reichert JM. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov, , 9(10): 767-774
[11]Beck A, Wurch T, Bailly C, et al. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol, , 10(5): 345-352
[12]Rother RP, Rollins SA, Mojcik CF, et al. Discovery and development of the complement inhibitor eculizumab for the treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Nature biotechnology, , 25(11): 1256-1264
[13]Aggarwal S. What's fueling the biotech engine- to . Nat Biotechnol, , 29(12): 1083-1089
[14]Datamonitor. Monoclonal antibodies reprot.
[15]Hughes B. Antibody-drug conjugates for cancer: Poised to deliver? Nat Rev Drug Discov, , 9(9): 665-667
[16]Holmes D. Buy buy bispecific antibodies. Nat Rev Drug Discov, , 10(11): 798-800
[17]Scolnik PA. Mabs: A business perspective. MAbs, , 1(2): 179-184
[18]陈志南., 杨向民. 基于抗体等重组蛋白表示产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术. 中国医药生物技术, , 4(5): 325-328
CHEN Z N, YANG X M. Chin Med Biotechnol,, , 4(5): 325-328
[19]Chen C. Challenges and opportunities of monoclonal antibody manufacturing in china. TTREBNDS IIN BIO/PHARMACEUTICAL INDUSTRY, , 5(3):
[20]陈志南. 基于抗体的中国生物制药产业化前景. 中国医药生物技术, , 2(1):2-5
CHEN Z N. , Chin Med Biotechnol, , 2(1):2-5
[21]Farid SS. Process economics of industrial monoclonal antibody manufacture. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, , 848(1): 8-18
[22]Kelley B. Industrialization of mab production technology: The bioprocessing industry at a crossroads. MAbs, , 1(5): 443-452
[23]Howard RG Clarke BJC. Comparing mammalian expression systems. BioProcess International,
[24]Vives J, Juanola S, Cairo JJ, et al. Metabolic engineering of apoptosis in cultured animal cells: Implications for the biotechnology industry. Metabolic engineering, , 5(2): 124-132
[25]Kevin Kayser NL, Dan Allison, Laurie Donahue, and Matt Caple. Cell line engineering methodsfor improving productivity. BioProcess International, ,
[26]Birch JR, Racher AJ. Antibody production. Advanced drug delivery reviews, , 58(5-6): 671-685
[27]Li F, Vijayasankaran N, Shen AY, et al. Cell culture processes for monoclonal antibody production. MAbs, , 2(5): 466-479
[28]Howard RG Clarke BJC. Comparing mammalian expression systems. BioProcess International, , 11(Supplement): 25-32
[29]Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, et al. Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production. Eur J Pharm Biopharm, ,
[30]Browne SM, Al-Rubeai M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends in biotechnology, , 25(9): 425-432
[31]Legmann R, Benoit B, Fedechko RW, et al. A strategy for clone selection under different production conditions. Biotechnology progress, , 27(3): 757-765
[32]Porter AJ, Dickson AJ, Racher AJ. Strategies for selecting recombinant cho cell lines for cgmp manufacturing: Realizing the potential in bioreactors. Biotechnology progress, , 26(5): 1446-1454
[33]van Berkel PH, Gerritsen J, Perdok G, et al. N-linked glycosylation is an important parameter for optimal selection of cell lines producing biopharmaceutical human igg. Biotechnology progress, , 25(1): 244-251
[34]Huang YM, Hu W, Rustandi E, et al. Maximizing productivity of cho cell-based fed-batch culture using chemically defined media conditions and typical manufacturing equipment. Biotechnology progress, , 26(5): 1400-1410
[35]Paula Decaria AS, and William Whitford. Many considerations in selecting bioproduction culture media. bioprocess int, ,
[36]Matthew Jerums XY. Optimization of cell culture media. BioProcess International, , SUPPLEMENT(38-44
[37]Fletcher T. Designing culture media for recombinant protein production: a rational approach. bioprocess int, ,
[38]Efren Pacis NV, Jincai Li, Martin Gawlitzek, Ashraf Amanullah, Feng Li. Systematic approaches to develop chemically defined cell culture feed media: It is important to ensure that the transition from peptone-containing to cd media doesn't affect product quality. BioPharm International Supplements, , 23(22):
[39]Kim BJ, Diao J, Shuler ML. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology progress, , 28(3): 595-607
[40]Hermes PA, Castro CD. A fully defined, fed-batch, recombinant ns0 culture process for monoclonal antibody production. Biotechnology progress, , 26(5): 1411-1416
[41]Burky JE, Wesson MC, Young A, et al. Protein-free fed-batch culture of non-gs ns0 cell lines for production of recombinant antibodies. Biotechnology and bioengineering, , 96(2): 281-293
[42]Khattak SF, Xing Z, Kenty B, et al. Feed development for fed-batch cho production process by semisteady state analysis. Biotechnology progress, , 26(3): 797-804
[43]Jardin BA, Montes J, Lanthier S, et al. High cell density fed batch and perfusion processes for stable non-viral expression of secreted alkaline phosphatase (seap) using insect cells: Comparison to a batch sf-9-bev system. Biotechnology and bioengineering, , 97(2): 332-345
[44]Wang L, Hu H, Yang J, et al. High yield of human monoclonal antibody produced by stably transfected drosophila schneider 2 cells in perfusion culture using wave bioreactor. Molecular biotechnology, ,
[45]Warnock JN, Al-Rubeai M. Bioreactor systems for the production of biopharmaceuticals from animal cells. Biotechnology and applied biochemistry, , 45(Pt 1): 1-12
[46]Konstantinov K, Goudar C, Ng M, et al. The "push-to-low" approach for optimization of high-density perfusion cultures of animal cells. Adv Biochem Eng Biotechnol, , 101(75-98
[47]Gomez N, Subramanian J, Ouyang J, et al. Culture temperature modulates aggregation of recombinant antibody in cho cells. Biotechnology and bioengineering, , 109(1): 125-136
[48]Restelli V, Butler M. The effect of cell culture parameters on protein glycosylation. Cell engineering, , 3: 61-92,
[49]Luo J, Zhang J, Ren D, et al. Probing of c-terminal lysine variation in a recombinant monoclonal antibody production using chinese hamster ovary cells with chemically defined media. Biotechnology and bioengineering, , 109(9): 2306-2315
[50]Kaschak T, Boyd D, Lu F, et al. Characterization of the basic charge variants of a human igg1: Effect of copper concentration in cell culture media. MAbs, , 3(6): 577-583
[51]Abu-Absi SF,