细菌分离培养及药敏试验方法及步骤.doc

细菌分离培养方法及操作步骤
无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。目前细菌分离培养得常用方法有平板划线分离法、加热分离法与实验动物分离法。
平板划线接种法
这就是目前临床上最常用得分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌得标本中分离出目得菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作：
1、 右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌；

图1 病料采集 图2 接种环灭菌
2、 待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食指为支点，用拇指与无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基得边缘。
3、 在涂布处来回移动作曲线形划线接种。（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划得线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。）
图3 平板划线接种法
4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。
注意：分离培养用得平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱得细菌有利。
细菌药敏试验方法操作步骤
药敏试验就是抗菌药使用以前必不可少得一个基本环节，一个正确得药敏结果能够科学得指导养殖户用药，减少抗菌素使用得盲目性，从而减少养殖户损失。在临床实际生产中具备重要意义。
1、 在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌得接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式； 用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿得1/2。然后，找到第二点划线至平皿得1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。

图4 接种环划线
2、 以无菌操作将灭菌得不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管得两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中得培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分得与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。
3、 添加药物：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

图5 添加药物
药敏试验结果：

图6 药敏试验结果
影响药敏结果得因素：
1、培养基:应根据试验菌得营养需要进行配制。倾注平板时,厚度合适，约56mm，不可太薄,一般90mm直径得培养皿,倾注培养基1820m为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物得拮抗物质,如钙、镁离子能减低氨基糖苷类得抗菌活性,胞腺密啶核苷与对氨苯甲酸(PABA)能拮抗磷胺药与TMP得活性
2、细菌接种量:细菌接种量应恒定,如太多,抑菌圈变小,能产酶得菌株更可破坏药物得抗菌活性。
3、药物浓度:药物得浓度与总量直接影响抑菌试验得结果,需精硫配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4、培养时间:一般培养温度与时间为37℃8-18小时,有些抗菌药扩散慢如多粘菌素,可将已放好抗菌药得平板培养基,先置4℃泳箱内2-4小时,使抗菌药预扩散,然后再放37℃温箱中培养,可以推迟细菌得生长,而得到较大得抑菌圈。温培养箱中培养18-24h后备用。