学术讨论—第五章-抗-体-制-药.ppt

第五章第五章 抗抗 体体 制制 药药第一页，共六十九页。第一节第一节 概概 述述 1890年年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清(xuqng)疗法，开抗体制药疗法，开抗体制药之先河。之先河。1937年年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、丙种（）球蛋白、丙种（）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。第二页，共六十九页。抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B B淋巴细胞被活化、增殖和分化淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。病人血清中具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白，病人血清中具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白，称为免疫球蛋白（称为免疫球蛋白（Immunoglobulin,IgImmunoglobulin,Ig）。）。Ig Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念，所有抗体是是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念，所有抗体是IgIg，但并，但并非所有非所有IgIg分子都有抗体活性。分子都有抗体活性。由于病原微生物是含有多种抗原决定由于病原微生物是含有多种抗原决定(judng)(judng)族的抗原物质，族的抗原物质，因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称为多克隆抗体。因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称为多克隆抗体。易出现非特异性交叉反应。易出现非特异性交叉反应。1975 1975年年Khler and MilsteinKhler and Milstein等首次利用等首次利用B B淋巴细胞杂交瘤技术制备出淋巴细胞杂交瘤技术制备出 McAb.McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。在临床上主要用于诊断和治疗。第三页，共六十九页。McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥），加速了排斥反应反应(fnyng)，在人体内的半衰期只有，在人体内的半衰期只有56h，难以维持有效药物作用靶组织时间；，难以维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。需要解决的问题：需要解决的问题：A、降低、降低McAb的免疫源性；的免疫源性；B、降低、降低McAb的相对分子质量。的相对分子质量。解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的抗体分子的1/801/3。第四页，共六十九页。第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体(kngt)（Monoclonal Antibody）一、制备单克隆抗体的一般流程一、制备单克隆抗体的一般流程 McAb McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对而产生的。由于这种抗体是针对(zhndu)(zhndu)一个抗原决定族的抗体，一个抗原决定族的抗体，又是单一的又是单一的B B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。第五页，共六十九页。第六页，共六十九页。第七页，共六十九页。1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫 免疫方法：体内免疫和体外免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物：免疫动物：BALB/c小鼠和小鼠和Lou大鼠大鼠 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本基本(jbn)方法：取适量脾细胞（方法：取适量脾细胞（1108）与骨髓瘤细胞（）与骨髓瘤细胞（21073107）进行混合，在）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释。第八页，共六十九页。第九页，共六十九页。用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为的毒性也随之增大。常用浓度为40%50%，相对分子质量，相对分子质量4000为佳。相对为佳。相对分子质量在分子质量在4006000，浓度在，浓度在10%60%范围内的范围内的PEG都能使细胞发生融合。都能使细胞发生融合。为了为了(wi le)提高融合率，在提高融合率，在PEG 溶液中加入溶液中加入DMSO（二甲基亚砜二甲基亚砜），以提高），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。（1）细胞融合液中的细胞类型：）细胞融合液中的细胞类型：4或或5种。种。（2）如何去除脾如何去除脾-瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性培养基瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性培养基第十页，共六十九页。第十一页，共六十九页。第十二页，共六十九页。第十三页，共六十九页。3 3、筛选阳性克隆与克隆化、筛选阳性克隆与克隆化 常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术技术 常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到9696孔板，使每孔中在理论上只含有一个孔板，使每孔中在理论上只含有一个(y)(y)细胞。第一次细胞。第一次克隆化时也要应用克隆化时也要应用HTHT培养液，以后的克隆化可用不含培养液，以后的克隆化可用不含HTHT的的RPMI 1640RPMI 1640培养液。培养液。软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入入9696孔板培养。孔板培养。第十四页，共六十九页。第十五页，共六十九页。第十六页，共六十九页。4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定(jindng)染色体分析染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为细胞为6268，NS-1为为5464，大多数，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反。反。第十七页，共六十九页。5 5、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大量制备 （1 1）体外培养法：可获得）体外培养法：可获得10g/ml10g/ml的抗体。多采用的抗体。多采用RPMI 1640RPMI 1640培养液，培养液，添加添加10%-20%10%-20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达量可达100 g/ml100 g/ml以上，给纯化以上，给纯化(chn hu)(chn hu)带来困难。加入小牛血清又是发带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。生长。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。法。无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。血清。此法虽可减少污染，但产量不高。悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达2 210107 7/ml,/ml,收集的单克隆抗收集的单克隆抗体可达体可达400 g/ml400 g/ml。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达10108 8/ml/ml。第十八页，共六十九页。（2）动物体内诱生法：可获得）动物体内诱生法：可获得(hud)10g/ml的抗体。常用的抗体。常用 基本程序：接种前基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或（降植烷）或用液体石蜡，然后注射用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，杂交瘤细胞，712d便有腹水生成，待生成便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。第十九页，共六十九页。6 6、单克隆抗体、单克隆抗体(kngt)(kngt)的纯化的纯化 根据根据IgIg的类和亚类以及用途选择不的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。同的纯化方法。体外诊断试剂体外诊断试剂IgGIgG类类-沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析 IgM IgM类类-沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和亲和层析层析+阴离子交换层析，注意除去毒素、阴离子交换层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。病毒、核酸等微量的污染物。第二十页，共六十九页。动物体内诱生法制备的动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序：纯化的一般程序：（1）澄清和沉淀处理：）澄清和沉淀处理：a.1000g 离心离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质）脂质）b.20 000g 高速离心高速离心30min,去除残留的小颗粒物质去除残留的小颗粒物质c.用用0.2 m微孔微孔(wi kn)滤膜过滤，去除细菌、支原体滤膜过滤，去除细菌、支原体d.饱和硫酸铵沉淀抗体（饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱和硫酸铵能回收饱和硫酸铵能回收90%以上的抗体）。以上的抗体）。第二十一页，共六十九页。（2 2）分离）分离 A A、凝胶过滤：用于、凝胶过滤：用于IgGIgG和和IgMIgM类。常用类。常用SephadexG 200 SephadexG 200 作为分离介质，可收集到作为分离介质，可收集到3 3个峰，最高峰为个峰，最高峰为IgMIgM，另外，另外(ln wi)(ln wi)两个峰为两个峰为 IgG IgG。抗体回收率达。抗体回收率达5080%5080%，能去，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达95%95%以上。以上。B B、阴离子交换层析：用于、阴离子交换层析：用于IgGIgG类的分离纯化。在类的分离纯化。在pH7.4pH7.4条件下，条件下，IgG1IgG1和和IgG2IgG2能结能结合在合在DEAEDEAE填料上，其中填料上，其中IgG2aIgG2a可在较低离子强度下洗脱下来，其纯度很高。可在较低离子强度下洗脱下来，其纯度很高。IgG2b IgG2b和和IgG3IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。较低。C C、亲和层析：多用蛋白、亲和层析：多用蛋白A A亲和层析。适用于亲和层析。适用于IgGIgG类。类。IgGIgG类与蛋白类与蛋白A A的结合与的结合与pH pH 有密切的关系。鼠源性单抗在有密切的关系。鼠源性单抗在 pH8.0 pH8.0时，时，IgG2bIgG2b、IgG3IgG3几乎全部结合在蛋几乎全部结合在蛋白白 A A柱上，柱上，IgG1 IgG1稍差，用稍差，用 pH3.5 pH3.5缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下 IgG2b IgG2b，pH4.0pH4.0缓冲液可洗缓冲液可洗脱下脱下 IgG3 IgG3，pH4.5pH4.5缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下IgG2aIgG2a，pH6.0 pH6.0可洗脱下可洗脱下IgG1IgG1。用蛋白。用蛋白A A亲亲和层析收获的抗体纯度和很高，但也有极微量的杂蛋白。和层析收获的抗体纯度和很高，但也有极微量的杂蛋白。第二十二页，共六十九页。二、鼠源性单克隆抗体的改造二、鼠源性单克隆抗体的改造 目的目的(md)(md)：一是降低免疫源性；：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。二是降低相对分子量，增加组织通透性。原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（子的可变区（V V），同种性免疫源性则决定于抗），同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（体分子的稳定区（C C）。）。第二十三页，共六十九页。第二十四页，共六十九页。第二十五页，共六十九页。第二十六页，共六十九页。第二十七页，共六十九页。鼠源性单克隆抗体的改造鼠源性单克隆抗体的改造 1 1、人、人鼠嵌合抗体（鼠嵌合抗体（chimeric antibodychimeric antibody）：在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的：在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的H H和和L L链的链的V V区基因分离出来，分别与人区基因分离出来，分别与人IgIg的的H H链和链和L L链的链的C C区基因连接，即成为人区基因连接，即成为人鼠嵌合抗体的鼠嵌合抗体的H H和和L L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的Chimeric Antibody.Chimeric Antibody.2 2、改型抗体、改型抗体(Reshaping antibody)(Reshaping antibody)：IgIg分子中参与构成抗原结合部位的区域是分子中参与构成抗原结合部位的区域是 H H和和L L链链 V V区中的互补性决定区区中的互补性决定区(CDR(CDR区区)。如果用鼠源性单克隆抗体的。如果用鼠源性单克隆抗体的CDRCDR序列序列(xli)(xli)替换人替换人 Ig Ig分子中分子中的的CDRCDR序列序列(xli)(xli)，则可使人的，则可使人的 Ig Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称CDRCDR移植抗体移植抗体(CDR (CDR grafting antibody)grafting antibody)。3 3、小分子抗体：基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的、小分子抗体：基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V V区片段，其相对分子质区片段，其相对分子质量仅为原抗体的量仅为原抗体的1/801/31/801/3。(1)Fab (1)Fab片段抗体：片段抗体：V VH H+C+CH1H1 (3)(3)单链抗体：单链抗体：V VH H-Linker-V-Linker-VL L (2)FV (2)FV抗体：抗体：V VH H+V+VL L (4)(4)单域抗体：单域抗体：V VH H或或V VL L （5 5）最小识别单位（）最小识别单位（MRUMRU）：单个）：单个CDRCDR区构成区构成 第二十八页，共六十九页。4、双功能抗体：双特异性抗体、双功能抗体：双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)。是一种非天然性抗体，。是一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。5、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。是、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。是20世纪世纪(shj)90年代发展年代发展的研究领域。类型如下：的研究领域。类型如下：（1）配基）配基配基型融合蛋白，如配基型融合蛋白，如 CD4-Fc.（2）配基）配基Ig型嵌合抗体，如型嵌合抗体，如 IL-2-Ig （3）配基）配基FV型嵌合蛋白，如型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4)受体受体FV型融合蛋白型融合蛋白 （5）酶）酶抗体型融合蛋白（抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）抗体酶）第二十九页，共六十九页。第三节第三节 基因工程基因工程(jyn gngchng)(jyn gngchng)抗体和抗抗体和抗体工程体工程抗体研究的三个阶段：抗体研究的三个阶段：以以18901890年年BehringBehring发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得疫动物来获得多克隆抗体多克隆抗体；以以19751975年年KhlerKhler创建杂交瘤技术制备创建杂交瘤技术制备单克隆抗体单克隆抗体为代表；为代表；以以19941994年年Winter Winter 以基因工程方法制备抗体为代表。它是以基因工程方法制备抗体为代表。它是抗体研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和抗体研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转而且还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产基因动物或转基因植物大规模生产(shngchn)(shngchn)抗体。在此基抗体。在此基础上发展成础上发展成抗体工程抗体工程。他创建了噬菌体抗体库（。他创建了噬菌体抗体库（Repertoire Repertoire of antibodies displayed on phagesof antibodies displayed on phages）技术）技术,克服了人体不能克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得人源性随意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。基因工程抗体。第三十页，共六十九页。一、噬菌体抗体库技术的基本一、噬菌体抗体库技术的基本(jbn)方法方法 1、获取目的基因、获取目的基因 2、抗体库技术的载体：、抗体库技术的载体：3、淘筛（、淘筛（panning）：）：4、表达与鉴定：。、表达与鉴定：。第三十一页，共六十九页。第三十二页，共六十九页。第三十三页，共六十九页。第三十四页，共六十九页。第三十五页，共六十九页。Western Blotting免疫(miny)印迹与与SouthernSouthern或或NorthernNorthern杂交方法类似，但杂交方法类似，但Western BlotWestern Blot采用的是采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的二抗。经过用标记的二抗。经过PAGEPAGE分离的蛋白质样品，转移到固相分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如载体（例如(lr)(lr)硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。第三十六页，共六十九页。二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库：抗体文库可以达到或超过、模拟天然全套抗体库：抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和和VL基因的随机重组也增加了抗体基因的随机重组也增加了抗体的多样性。的多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术：由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，、避开了人工免疫和杂交瘤技术：由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免用基因工程方法制备抗体，因而能避免(bmin)使用人工免疫动物和细胞融合技术。使用人工免疫动物和细胞融合技术。3、可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，、可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，VH和和VL基因的随机重组模拟了体内基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。力的人源化抗体。第三十七页，共六十九页。第三十八页，共六十九页。第三十九页，共六十九页。第四十页，共六十九页。第四十一页，共六十九页。抗体诊断抗体诊断(zhndun)试剂和抗体治疗药物试剂和抗体治疗药物 第四节第四节第四十二页，共六十九页。一、抗体诊断试剂一、抗体诊断试剂 抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表现为抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊断药物基体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的和免疫本分为三类：血清学鉴定用的和免疫(miny)标记技术用的抗体制剂，以及体内导标记技术用的抗体制剂，以及体内导向诊断药物向诊断药物 习惯上体外试验用的称试剂，体内导向诊断用的称药物。习惯上体外试验用的称试剂，体内导向诊断用的称药物。第四十三页，共六十九页。1 1、血清学鉴定用的抗体类试剂、血清学鉴定用的抗体类试剂 （1 1）鉴定病原菌用的抗体试剂）鉴定病原菌用的抗体试剂 A A、常用诊断血清的品种和用途、常用诊断血清的品种和用途 B B、诊断血清的制备步骤、诊断血清的制备步骤 a a、制备细菌、制备细菌(xjn)(xjn)抗原：细菌抗原：细菌(xjn)(xjn)接种接种-培养培养-收集菌苔收集菌苔-沸水沸水2.5h-2.5h-制成菌液。制成菌液。b b、免疫动物和制备抗体血清：抗原稀释后免疫动物：家兔、免疫动物和制备抗体血清：抗原稀释后免疫动物：家兔、马、羊、豚鼠。马、羊、豚鼠。免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数3-73-7次，每次间隔次，每次间隔3-3-4d4d，末次注射后，末次注射后6-8d6-8d取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。C C、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应，镜检、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应，镜检第四十四页，共六十九页。第四十五页，共六十九页。（2）乙型肝炎病毒表面抗原（）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂的反向被动血凝诊断试剂 A A、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯吸附蛋白质，当纯化的抗化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在(cnzi)有有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。B、制备步骤：先用、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠免疫豚鼠-获得抗获得抗HBs血清血清-硫酸铵盐析硫酸铵盐析/柱层析柱层析-取其取其 IgG-在在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞-洗去多余蛋白成分，用含洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。液稀释至一定浓度，分装即成。C、诊断方法：、诊断方法：RPHA（reverse passive hemagglutination)反向被动血凝试反向被动血凝试验，即用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原验，即用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原 在在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，血细胞沉积于型血凝板上进行，阴性样品不凝集，血细胞沉积于V型孔底部，呈尖型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。点状；阳性样品血细胞凝集成块状。第四十六页，共六十九页。（3 3）妊娠诊断试剂）妊娠诊断试剂 妇女妊娠后，血液和尿液中的妇女妊娠后，血液和尿液中的HCGHCG含量增含量增高，在高，在3 3个月内可达到高峰。此时检测尿个月内可达到高峰。此时检测尿液中的液中的HCGHCG，就可确定是否怀孕，就可确定是否怀孕(hui yn)(hui yn)（4 4）抗）抗ABOABO血型系统血清血型系统血清第四十七页，共六十九页。第四十八页，共六十九页。第四十九页，共六十九页。2 2、免疫标记技术用的抗体类试剂、免疫标记技术用的抗体类试剂 给抗体标记给抗体标记(bioj)(bioj)放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。供手段。（1）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素（如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明）、罗丹明（RB200）、藻红素（）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。定位的目的。（2）免疫酶抗体诊断试剂：用酶标记抗体检验抗原的方法）免疫酶抗体诊断试剂：用酶标记抗体检验抗原的方法 a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 b、HBeAg(乙型肝炎乙型肝炎e抗原抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 d、测定、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂 e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂（甲胎蛋白）酶标诊断试剂 用于原发性肝癌的辅助诊断用于原发性肝癌的辅助诊断 f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂（癌胚抗原）酶标诊断试剂 用于消化道恶性肿瘤的鉴别诊断用于消化道恶性肿瘤的鉴别诊断第五十页，共六十九页。第五十一页，共六十九页。第五十二页，共六十九页。第五十三页，共六十九页。（3）放射免疫用抗体）放射免疫用抗体(kngt)诊断试剂诊断试剂 把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出能测出ng/ml，甚至，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。水平的微量抗原物质。常用的标记抗体试剂：常用的标记抗体试剂：a、HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度0.1 ng/ml b、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度0.1 ng/ml c、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记标记 d、AFP放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度15 ng/ml e、CEA放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度1 ng/第五十四页，共六十九页。3、导向诊断药物、导向诊断药物(yow)由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药物还未在临床广泛应用。物还未在临床广泛应用。第五十五页，共六十九页。第五十六页，共六十九页。二、抗体治疗二、抗体治疗(zhlio)药物（体内用药物）药物（体内用药物）以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有20多年的历史，多年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，受试病人超过数千例。但治疗用的制剂尚没有一种达到原，受试病人超过数千例。但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物商品化的程度。在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅30%。目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规治疗的应目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规治疗的应用阶段。用阶段。障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能达到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应。达到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应。第五十七页，共六十九页。（一）.放射性核素标记的抗体治疗(zhlio)药物第五十八页，共六十九页。（二）抗癌药物(yow)偶联的抗体药物(yow)第五十九页，共六十九页。第六十页，共六十九页。(三）毒素(d s)偶联的抗体药物第六十一页，共六十九页。第六十二页，共六十九页。CD4CD4细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞，在细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞，在T T细胞的表细胞的表面。这些面。这些CD4CD4细胞又称为免疫系统的辅助手（细胞又称为免疫系统的辅助手（helperhelper），能指），能指挥身体对抗微生物和病毒。挥身体对抗微生物和病毒。由于艾滋病病毒攻击对象是由于艾滋病病毒攻击对象是CD4CD4细胞，所以其检测结果对艾滋细胞，所以其检测结果对艾滋病治疗效果的判断和对患者免疫功能的判断有重要作用。正常病治疗效果的判断和对患者免疫功能的判断有重要作用。正常成人的成人的CD4CD4细胞在每立方毫米细胞在每立方毫米500500个到个到16001600个，艾滋病病毒感染个，艾滋病病毒感染者的者的CD4CD4细胞出现进行性或不规则性下降，标志着免疫系统受细胞出现进行性或不规则性下降，标志着免疫系统受到严重损害到严重损害(snhi)(snhi)，当，当CD4CD4细胞小于每立方毫米细胞小于每立方毫米200200个时，可能个时，可能发生多种机会性感染或肿瘤。目前最新规定发生多种机会性感染或肿瘤。目前最新规定hivhiv感染者的感染者的CD4CD4记记数水平低于数水平低于350350个就可以开始治疗。个就可以开始治疗。第六十三页，共六十九页。第六十四页，共六十九页。（4）免疫毒素的临床(ln chun)应用第六十五页，共六十九页。第六十六页，共六十九页。第六十七页，共六十九页。第五章 1.1.解释解释.HBsAg RPHA Ig Ab McAb.HBsAg RPHA Ig Ab McAb ELISA RT-PCR HIV AFP CEA ELISA RT-PCR HIV AFP CEA2.2.简述简述McAbMcAb制备制备(zhbi)(zhbi)的一般流程的一般流程3.3.如何改造鼠源性单抗如何改造鼠源性单抗4.4.简述简述McAbMcAb制备的两种方法（体外培养和体内诱生）制备的两种方法（体外培养和体内诱生）5.5.简述抗体研究的三个阶段简述抗体研究的三个阶段6.6.噬菌体抗体库的特点噬菌体抗体库的特点7.7.什么叫抗体诊断试剂什么叫抗体诊断试剂8.8.抗体诊断药物分几类抗体诊断药物分几类9.9.免疫标记类抗体试剂有哪些免疫标记类抗体试剂有哪些10.10.简单介绍抗体治疗药物简单介绍抗体治疗药物第六十八页，共六十九页。内容(nirng)总结第五章 抗 体 制 药。抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化(chn hu)方法。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术第六十九页，共六十九页。