散发性结直肠癌错配修复基因hMLH1的研究进展.docx

散发性结直肠癌错配修复基因hMLH1的研究进展

【关键词】 直肠癌
结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是我国一种常见的恶性肿瘤,占胃肠道肿瘤的第二位[1]，近年发病率有上升的趋势，国外报道占胃肠道肿瘤的第三位,其死亡率占肿瘤死亡的第四位。早在20世纪50年代, 研究者们就提出肿瘤的发生可能为一个多步骤多环节的过程,直到70年代中期随着分子生物学医学技术的发展,发现了癌基因和抑癌基因,分析肿瘤的形成包括原癌基因的激活和/或抑癌基因的失活的过程，才得以在分子水平上研究其机制。在大肠癌的发生途径中，除了经典的染色体不稳定途径外，1993年Ionow和Aaltonen等首次发现,在几乎所有HNPCC肿瘤和约12%～15%的散发性CRC中存在着微卫星上的突变,称作微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI) ,由此提出了另一条途径——错配修复途径
1 错配修复基因hMLH1的发现
错配修复基因是纠正碱基错配的主要因子，它不同于其它抑制基因对细胞的无序增长具有直接的作用，而是通过修复DNA复制过程中产生的错误，维持基因组的稳定性，避免突变，间接抑制肿瘤的发生。目前已发现人类的MMR系统含有9个错配修复基因，其中以hMLH1和hMSH2功能最为重要,hMSH2和hMLH1基因突变占所有检测到突变的90 %以上。hMLH1是继Fishel等在1993年在HNPCC细胞中首先分离出与大肠杆菌mutS同源的hMSH2之后的MMR家族中的又一个错配基因的发现。该基因定位于3p21，是细菌错配修复基因mutl的同源物，与大约30％的HNPCC有关，hMLH1的cDNA全长2484 hp，编码长度为2268bp的开读框架，hMLH1蛋白由756个氨基酸残基组成，与酵母错配修复基因hMLH1比较有41％的同源性，hMLH1在结直肠癌中可能起着一种看家基因的作用。在部分HNPCC患者中hMLH1基因在第4l位密码子有一个C—T 突变，使相应的氨基酸残基由丝氨酸变成苯丙氨酸.另外，在HNPCC的患者中还检测到了第578至632位密码子之间的杂合性缺失及从第727位密码子的第一个核苷酸开始的4个核苷酸的缺失，在另外一些病例的第519位密码子则存在一个T的插入，造成hMLH1蛋白产物的羧基端238个氨基酸残基的缺失。另外，张晓梅等在结直肠癌患者的体细胞中发现了位于hMLH1基因第ll5l位碱基T—A的杂合型颠换，导致其第384位编码氨基酸由缬氨酸(Va1)突变为天冬氨酸(Asp)，随后的研究结果表明，Va1384Asp作为东亚人hMLH1基因上的一个多态位点。
2 错配修复基因的功能和作用机制
hMLH1和其它的MMR基因的基本功能一样，是消除DNA复制过程中由于DNA 聚合酶滑移而引起碱基碱基错配和插入缺失突环的形成。碱基碱基错配损害主要影响非重复的DNA,从而导致单碱基的错配,表现为DNA复制错误(replication errors,RER),而插入缺失环的形成会影响DNA重复序列,引起短重复序列的插入或缺失,亦可表现为微卫星的插入或缺失,从而表现为微卫星不稳定(microsatellite instablility,MSI)性。DNA复制过程中,在复制一个重复单位后,子链与模板链分离, 然后与下一个或下几个重复单位重新结合,使一个或几个重复单位形成“环凸”区域。正常情况下该结构可被MMR系统所校正, 但MMR系统失常时,子链DNA如继续延伸即可引起突变。目前MMR基因的作用机制仍不很清楚, 推测可能是人类MMR基因编码的错配修复蛋白可相互作用形成一种多聚复合物,参与细胞错配修复反应。hMLH1和hPMS2蛋白形成hMutLα二聚体,与结合到DNA链上的hMutS形成一种暂时性的复合物,从而启动错配修复,在DNA聚合酶Ⅲ、DNA连接酶、单链结合蛋白、外切核酸酶及增殖细胞核抗原等的参与下,切除含有错配碱基的一段DNA链,然后重新合成一段DNA链,这样就修复了含错配碱基的DNA核苷酸链。结直肠杆菌细胞中的这种修复机制是通过错配修复系统识别碱基正确的母链和错配的子链来进行修复反应的，即利用两条链的甲基化状态的不同来进行区别的。一般DNA复制后,子链会在甲基化酶的作用下被甲基化,但在子链合成后的很短时间内,其不会被甲基化,这样错配修复系统能区分甲基化的母链和非甲基化的子链,这种修复机制被认为是甲基导向错配修复机制(methyl directed mismatch repair)，人类错配修复系统也需这种作用。
3 MMR基因hMLH1的检测
人们使用各种不同的方法对包括散发性结直肠癌在内的癌症病人的hMLH1基因改变及其引起的相关改变进行检测，目前常用的方法正常或肿瘤组织的微卫星序列通过PCR扩增，聚丙烯凝胶电泳分离或者通过荧光PCR自动生成以检测肿瘤组织的微卫星不稳定性；通过异源双链分析检测hMLH1功能；hMLH1突变的直接检测包括，基于DNA 的检测技术如PCRSSCP、DGGE，基因组DNA测序；基于RNA的检测技术如RTPCR，cDNA测序等方法。另外较常用的体外耦联的转录翻译反应技术(IVTT)；通过甲基化特异性PCR，检测hMLH1基因甲基化状态，这些方法各有其优缺点，微卫星不稳定性可以间接反映错配修复系统是否失活，较为简单、可靠，但只能间接反应错配修复系统的总体情况，而不能直接反映错配修复系统是如何失活的，而且MSI与其它多种因素都有关系，单单MSI不能肯定说明MMR系统的改变；异源双链分析用于检测基因功能，因此只能检测基因的功能，而不能反映基因到底是如何发生变化的；SSCP或DGGE可以检测MMR基因突变情况，但每次反应只能检出检测基因的个别外显子；IVTT法用于检测移码突变，hMLH1基因有40％为移码突变 ，该方法可以快捷、有效、可靠地检出基因突变造成的截短型蛋白质，但无法检测其他的突变，如错义突变、部分移码突变等不造成蛋白质截短的MMR基因突变；检测MMR基因甲基化状态可以反映MMR基因甲基化情况，对于肿瘤非遗传机制的研究可以提供一个依据，但甲基化状态的研究反映的只是MMR基因发生改变的可能的一小部分机制而已。因此，在对MMR基因进行研究时，我们有必要时以上技术进行筛选，选其中的几个方法进行实验，使它们能取长不短。
4 散发性结直肠癌
　临床特点 散发性结直肠癌临床特点：①无一级或二级亲属患结直肠癌者。②肿瘤多见于右半结肠。③散发性结直肠癌以DukesB期为主。④病理形态以隆起型多见。MMR基因保证了DNA复制的高度保真,一旦MMR基因发生突变或启动子甲基化引起错配修复基因失活导致机体错配修复功能的降低,进而导致整个基因组的不稳定,MMR功能缺陷的表现型是高度的微卫星不稳定(MSIH) ,又称之为复制错误( replication error, RER)阳性，RER阳性的散发性CRC与RER阴性者相比,具有不同的临床病理、分子生物学特征,表现为:发病年龄较小；多位于近端结肠,且易伴发肠内或肠外其他器官的多发性肿瘤;对某些化疗药物(如5FU、顺铂等)有原发性耐药;肿瘤细胞DNA多为二倍体或近二倍体;低分化腺癌、黏液腺癌及印戒细胞癌多见,但较少发生淋巴结转移,生物学行为较好。近年研究发现, hMLH1蛋白的表达变化结果可以很好地预示MMR功能缺陷的存在。
　基因诊断 近年研究表明,MMR基因中的hMLH1基因与结直肠癌的发生有非常重要的作用，而错配修复基因的单核苷酸多态性被认为对结直肠癌的诊断提供了很有用的信息，但是在我国有极少这方面的研究证实这种关系[10]。Platz EA等[11]认为核苷酸切除修复基因遗传多态性与结直肠癌的恶性程度有关。Gryfe等[12]报道MMR功能缺失所致的HNPCC主要表现为hMSH2的表达缺失,其表达的缺失与体细胞突变相关,并且这些肿瘤具有较好的生物学行为和预后。Ericaon等[13]报道87 %的HNPCC有MMR 基因的蛋白表达缺失,其中hMSH2 表达缺失率49%,hMLH1的表达缺失率为39%。在散发性结肠癌中也发现有MMR 系统的功能缺失,尤其是hMLH1和hMSH2的突变是造成某些散发性结肠癌发生的主要原因。不过在散发性结肠肿瘤hMLH1表达缺失率高于hMSH2。主要是由于hMLH1基因启动子甲基化导致hMLH1基因的转录和翻译而出现蛋白的表达缺失与微卫星不稳定性引起 ,表明hMLH1基因的突变在散发性结肠癌的发生过程中占有重要的地位。Lind 检测1114例散发性结直肠癌hMLH1和hMSH2的表达，发现228例出现hMLH1表达缺失，98例出现hMSH2的表达缺失，认为免疫组化是快速有效的检测DNA错配修复缺陷的方法，敏感度为％，特异度100％[14]。
　　5 错配修复基因突变与散发性结直肠癌的关系 MMR 基因发生突变将致细胞修复错误碱基的功能降低或缺乏，产生结直肠肿瘤细胞DNA微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)与DNA复制差错(replication error，RER)阳性，从而使患者肿瘤易感 。Petmitr S等[15]认为错配修复基因的失活和微卫星不稳定性在散发性结直肠癌的发展过程中可能扮演了一个不可忽视的角色。更为重要的是MMR缺陷会使某些癌基因和抑癌基因的突变得到快速积累，最终影响正常细胞的增殖调控。现已基本确定，MMR基因发生突变导致DNA错配修复系统功能缺陷或丧失是HNPCC肿瘤发生的前提条件。我国的曲灵等对60例散发性结直肠癌的错配修复基因的研究，发现hMLH1的表达缺失达到%，与国外的Chiaraualli等的研究结果基本一致。Wheeler JM等研究表明，在散发性结肠癌中也发现有MMR系统的缺陷或丧失，一般散发性结肠癌患者DNA中RER 检出率约为15%[16]，不过在散发性结肠肿瘤中，MMR 基因的突变情况和HNPCC 中的突变有所不同，表现为hMLH1基因的突变率远远高于hMSH2基因的突变率。近年来研究发现MSI 的散发性结肠癌中hMLH1等位基因缺失程度较高，而hMSH2等位基因方式缺失的现象极少，这说明hMLH1基因的突变在散发性结肠癌的发作过程中占有重要的地位，提示散发性结肠癌发生可能存在与HNPCC不一样的机制[17]。对于MMR系统的其它基因hPMS1，hPMS2和hMSH6等，并未检测出有何突变。提示这几个基因不是散发性结肠癌发生的候选基因。
6 问题与展望
近年来尽管已经对包括hMLH1在内的MMR缺陷与结直肠肿瘤发生的关系有了较深的研究。但是，尚有很多问题有待解决。①MMR缺陷影响细胞凋亡的信号转导与机制目前尚不明确，需要医学工作者不断的深入的研究。②MMR系统与抑癌基因、癌基因之间的相互关系有待进一步研究。③该组基因在参与细胞增殖调控的作用方式及机制需更深人的研究。④目前在很多医院，对结直肠癌的癌前基因的检测尚未普及或未开展，且对结直肠癌预后的没有跟踪检测[18]，因此需要建立完善且方便的检测方法十分必要。⑤该组基因对微粒体影响的分子机制仍需更进一步的研究。
【参考文献】
[1]郑芝田.胃肠病学[M]. 第3 版. 北京:人民卫生出版社, 857871.
Miguel A. RodriguezBigas, Edward H. Lin, and Christopher H. Crane. Adenocarcinoma of the Colon and Rectum[M].cancer medicine，2003.
Haydin AM, Jass JR. Emerging pathways in colorectal cancer development[J].Lancet Oncol,2002,3:8388.
YuZ,Chen,,BN,et :anoverview［J］.Environ,Mol,Mutagen,1999,33:320.
金黑鹰,等. 中国人HNPCC家系中hMSH2 基因新突变及其功能分析[J].第二军医大学学报，2005，8：888891.
Kristine Kleivi, Guro E Lind, Chieu B Diep,et al. Gene expression profiles of primary colorectal carcinomas, liver metastases, and carcinomatoses[J].Mol Cancer，2007,6:2.
朱丽瑾，等.错配修复基因与散发性肿瘤[J].中国肿瘤，2002，11：524526.
l,uce MC，Binnie　MC,et　of DNA mismatch repair gene mutations in hereditary nonpolyposis colon cancer patients[J].Int JCancer，1996，69：50.
李卫，等. 广西β地中海贫血基因突变类型SSCP分析[J].广西医科大学学报,1999:16(3):259.
[10]Qian Meia,HongLi Yana,Xue G,et al. Singlenucleotide Polymorphisms of mismatch repair genes in healthy Chinese individuals and sporadic colorectal cancer patients[J].Cancer Genet Cytogenet,2006,171(1):1723.
[11]Sonja ,Elizabeth , Fallinal,et al. Genetic variation in the nucleotide excision repair pathway and colorectal cancer risk[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2006,15(11):22639.
[12]Gryfe R，Ganinger　instability，mismatch repair deficiency，and colorectal cancer[J].Surgery，2001，130(11)：1720.
[13]Ericson K，Halvarsson B，Nagel J，et　mismatch repair in patents with mutiple many tumours including coloreetal cancer[J].Eur J Cancer，2003，39(2)：240248.
[14]Lindor N M，Burgart L J，Leontovich O，et　VerSUS microsatellite instability testing in phenotyping colorectal cancer[J].Jclin Oncol，2002，20(4)：10431048.
[15]Petmitr S,etal. Novel hMSH2, hMSH6 and hMLH1 gene mutations and microsatellite instability in sporadic colorectal cancer[J]. J Cancer Res Clin Oncol,2007,133(1):6570.
[16]Wheeler JM. Epigenetics, mismatch repair genes and colorectal cancer[J].Ann R Coll Surg Engl,2005,87(1):1520.
[17]I M Frayling. Methods of molecular analysis: mutation detection in solid tumours[J].J Clin Pathol: Mol Pathol,2002,55:7379.
[18]Kristine Kleivi, Guro E Lind,Chieu B Diep,et al. Gene expression profiles of primary colorectal carcinomas, liver metastases, and carcinomatoses[J].Mol Cancer，2007,6:2.