气相色谱法快速测定水蛭中短链脂肪酸含量_黄飞.pdf

天 津 中 医 药 大 学 学 报Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine第 42 卷第 1 期2023 年 2 月Vol42No1Feb2023摘要：目的 建立水蛭中短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸）的含量测定方法。方法 采用气相色谱法以 2-乙基丁酸和 2-乙基己酸为内标物，同时测定水蛭样品中 7 种短链脂肪酸的含量。采用 DB-FFAP弹性石英毛细管柱（30 m0.25 mm0.25 m）程序升温分离各成分，以氢火焰离子化检测器检测（检测器温度：240 ），进样口温度：240，载气：高纯氮气，流速 1.0 mL/min；尾吹气：高纯氮气，流速 25 mL/min。结果 不同批次水蛭样品中各短链脂肪酸含量差异较大，短链脂肪酸总含量范围为 1 1018 571 g/g，其中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、己酸的含量范围分别为 783.03 479、246.75 166、087.73、073.02、0112.8、065.65 g/g。结论 研究建立的水蛭中短链脂肪酸的含量测定方法简便、快速、稳定，可为水蛭的质量控制提供依据。关键词：水蛭；短链脂肪酸；气相色谱中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：16739043（2023）010103-05气相色谱法快速测定水蛭中短链脂肪酸含量*黄飞，李灵云，于卉娟，王跃飞，崔英，柴欣（天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津市中药化学与分析重点实验室，天津301617）*基金项目：国家中医药管理局中医药创新团队及人才支持计划项目（ZYYCXTD-D-202002）。作者简介：黄飞（1996-），男，硕士研究生在读，主要从事中药质量控制方向研究。通讯作者：柴欣，E-mail：。引用格式：黄飞，李灵云，于卉娟，等.气相色谱法快速测定水蛭中短链脂肪酸含量J.天津中医药大学学报，2023，42(1)：103-107.DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2023.01.19水 蛭 为 水 蛭 科 动 物 蚂 蟥（WhitmaniapigraWhitman）、水蛭（Hirudonipponica Whitman）或柳叶蚂蟥（Whitmaniaacranulata Whitman）的干燥全体，始载于 神农本草经：“性平，味咸，苦，归于肝经，主逐恶血，瘀血，经闭，破血瘕积聚，无子，利水道。”1具有破血通经、逐瘀消瘕等功效2。现代药理学研究表明水蛭具有抗凝、抗血栓、抗肿瘤、抗炎等多种活性3-6，常用于心脑血管疾病的治疗7-8。水蛭化学成分主要包括水蛭素等多肽类成分及碟啶、糖脂、不饱和脂肪酸、甾体、氨基酸等小分子成分9-12；水蛭素是具有良好抗凝活性的多肽大分子，但多肽分子经口服给药后在胃肠道中被降解，且在炮制过程中易被破坏13。因此，关于水蛭活性成分的研究仍是该领域的热点问题14-15。短链脂肪酸是一类由 16 个碳原子组成的饱和脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、异丁酸、异戊酸16。人体中的短链脂肪酸主要是由未消化的膳食纤维、蛋白质及碳水化合物经肠道微生物代谢生成，其中乙酸、丙酸、丁酸约占总量的 95%17。短链脂肪酸具有抗炎、降低血压、调节免疫等作用，与心血管疾病、糖尿病、慢性肾脏病的发生和发展关系密切18-19。水蛭中的肠道微生物也可以代谢未消化的食物生成短链脂肪酸20，但目前对于水蛭中的短链脂肪酸研究较少。本研究基于气相色谱法建立了一种可以同时测定水蛭中 7 种短链脂肪酸含量的方法，并将该方法应用于 18 批水蛭样品中短链脂肪酸的分析，有助于揭示水蛭短链脂肪酸的分布规律，为水蛭的质量控制提供方法学支撑及研究数据。1仪器与材料GC-7890B 气相色谱仪（美国 Agilent 公司）；DB-FFAP 毛细管柱（30 m0.25 mm0.25 m，美国Agilent 公司）；XS205 十万分之一电子天平、AL204万分之一电子天平（瑞士 METTLERTOLEDO 公司）；SB25-12DTN 超声波清洗器（宁波新芝科技有限公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国 Millipore 公司）。103天 津 中 医 药 大 学 学 报Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine第 42 卷第 1 期2023 年 2 月Vol42No1Feb2023无水乙醇、浓盐酸（天津大茂化学试剂厂）；超纯水（自制）；乙酸（批号：BCBL0846V）、丙酸（批号：BCBK8610V）、异丁酸（批号：MKBG7913V）、丁酸（批号：BCBH0489V）、异戊酸（批号：MKBP6045V）、戊酸（批号：MHBM7442V）、己酸（批号：BCBJ3105V）、2-乙基丁酸（批号：STBD2230V）、2-乙基己酸（批号：MKBH9137V）均购自于美国 Sigma-Aldrich 公司，纯度均大于 99%。水蛭样品 S1S7 购自河北安国药材交易市场，S8-s、S9-s、S10-s、S11-s、S18-s 采购于各水蛭养殖基地并加工干燥而成，S12S17 由牡丹江友博药业股份有限公司提供。所有水蛭药材由天津中医药大学李天祥教授鉴定，均来源于蚂蟥（Whitmaniapigra Whitman）。2方法2.1对照品溶液的制备取乙酸、丙酸对照品适量，精密称定，分别置于 10 mL 容量瓶中，加 25%乙醇溶液（V/V）定容；取异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸对照品适量，精密称定，分别置于 10 mL 容量瓶中，加乙醇定容，得到对照品储备液；浓度分别为乙酸 10.383 mg/mL、丙酸 9.161 mg/mL、异丁酸1.077 mg/mL、丁酸 6.948 mg/mL、异戊酸 2.905 mg/mL、戊酸 0.796 mg/mL、己酸 0.792 mg/mL；取 2-乙基丁酸、2-乙基己酸对照品适量，精密称定，分别置于100 mL 容量瓶中，以 75%乙醇溶液定容，得浓度为2-乙基丁酸 933.2 g/mL、2-乙基己酸 192.7 g/mL的内标物储备液，置于 4 冰箱中备用。分别取各对照品及内标物储备液适量于 10 mL容量瓶中，加浓盐酸 100 L，以 25%乙醇溶液定容，即得浓度为乙酸 1 038.3 g/mL、丙酸 916.1 g/mL、异丁酸 107.7 g/mL、丁酸 694.8 g/mL、异戊酸290.5 g/mL、戊酸 79.6 g/mL、己酸 79.2 g/mL、2-乙基丁酸 46.3 g/mL、2-乙基己酸 2.4 g/mL 的混合对照品溶液，并以 25%乙醇溶液（含 1%盐酸、2-乙基丁酸 46.3 g/mL、2-乙基己酸 2.4 g/mL）11 逐级稀释成一系列不同浓度的混合对照品溶液。2.2供试品溶液的制备取水蛭样品粉末 0.2 g 置于 10 mL 容量瓶中，加入 25%乙醇溶液（含 1%盐酸、2-乙基丁酸 46.3 g/mL、2-乙基己酸 2.4 g/mL）冰浴超声 10 min，定容，摇匀，14 000 r/min 离心 10 min（离心半径为 8.4 cm），取上清液，即得供试品溶液。2.3色谱条件色谱柱：DB-FFAP 弹性石英毛细管柱；升温程序：初始温度 50保持 1min，以 50/min升至 120，以 5/min 升至 165，以 100/min升至 240 后保持 13 min；进样口温度：240；检测器（FID）温度：240；进样体积：3L；分流比 101；载气：高纯氮气，纯度99.999%，流速 1.0 mL/min；尾吹气：高纯氮气，纯度99.999%，流速 25 mL/min；氢气流速 30 mL/min；空气流速 400 mL/min。3结果3.1方法学验证取“2.1”项下配制的一系列不同混合对照品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进行分析，以对照品浓度 x（g/mL）为横坐标，以各化合物峰面积（ASA）与内标物峰面积（AIS）比值（ASA/AIS，乙酸、丙酸、丁酸以 2-乙基丁酸为内标物，异丁酸、异戊酸、戊酸、己酸以 2-乙基己酸为内标物）y 为纵坐标，绘制各对照品的标准曲线，计算出标准曲线的回归方程和相关系数（r2）；以信噪比 S/N=3为检测限（LOD）、S/N=10 为定量限（LOQ），实验结果见表 1。各成分在相应的浓度范围内线性关系良好，r2值均大于 0.999 9。按照“2.2”项下的方法制备水蛭供试品溶液，进行日内精密度、日间精密度（每日分别制备供试品溶液）、稳定性、重复性实验。各化合物日内精密度与日间精密度 RSD 值均小于 3.3%；各成分重复性实验 RSD 值均小于 3.2%；各成分在冰浴条件下 9 h 内稳定性良好，RSD 值均小于 3.6%。实验结果见表 1。在此基础上，开展水蛭样品中各短链脂肪酸的加样回收率实验，取水蛭样品粉末 0.1 g，置于 10 mL容量瓶中，准确加入与样品中各成分质量相当的混合对照品溶液 5 mL（乙酸 175.69 g/mL、丙酸100.77 g/mL、异丁酸 6.89 g/mL、丁酸 84.77 g/mL、异戊酸 12.78 g/mL、戊酸 2.55 g/mL），按“2.2”项下方法平行制备 6 份供试品溶液。计算各成分的加样回收率和 RSD 值，结果见表 1。各成分平均加样回收率为 92.52%100.8%，RSD 值均小于 2.8%。3.2不同来源水蛭中短链脂肪酸含量测定采用建立的气相色谱方法分析水蛭中 7 种短链脂肪酸的含量，气相色谱图见图 1，结果显示各短链脂肪酸分离度良好，空白溶剂和内标物化合物对短链脂肪酸分析无影响。采用构建的方法对 18 批水蛭样品中 7 种短链脂肪酸进行含量测定，为了更加直观地观察不同批次水蛭中短链脂肪酸的差异，绘制了水蛭中短链脂肪酸总含量柱状图，并以水蛭样品中短链脂肪酸含量最大值为参照计算水蛭中各短链脂肪酸的相对含量，绘制各短链脂肪酸的相对含量热图，结果见104天 津 中 医 药 大 学 学 报Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine第 42 卷第 1 期2023 年 2 月Vol42No1Feb2023图 2。结果表明 18 批水蛭样品中短链脂肪酸总含量在 1 1018 571 g/g；不同批次水蛭样品中各成分含量差异较大，其中乙酸、丙酸的相对含量较高，含量范围分别为 783.03 479 g/g 和 246.75 166 g/g。水蛭样品中其他短链脂肪酸含量较低，仅在 S2 中检测到丁酸，其含量为 73.02 g/g；在 S2、S8-s、S9-s、S17、S18-s 中检测到异丁酸含量为 36.8387.73 g/g，其他样品未检测到异丁酸；18 批水蛭样品中均未检测到戊酸；在 13 批水蛭样品中检测到异戊酸含量为5.117112.8 g/g，其他样品未检测到异戊酸；仅在S1 和 S17 中检测到己酸，其含量分别为 65.65g/g 和44.11 g/g。4讨论4.1水蛭样品供试品溶液制备方法的优选优选表 1水蛭中短链脂肪酸的方法学验证实验结果化合物回归方程r2线性范围（g/mL）LOD（g/mL）LOQ（g/mL）精密度（RSD，%）稳定性（n=10，RSD，%）重复性（n=6，RSD，%）加样回收率（n=6）日内（n=6）日间（n=3）平均回收率（%）RSD（%）AAy=0.008 4x-0.009 00.999 98.11 038.30.040.10.70.91.51.195.202.3PAy=0.013 9x-0.032 40.999 97.2 916.10.040.10.90.91.51.092.761.5i-BAy=0.365 4x-0.087 90.999 90.8 107.70.030.13.11.03.62.394.342.6BAy=0.016 7x-0.002 40.999 95.4 694.80.030.10.60.60.80.792.521.1i-VAy=0.426 5x-0.210 40.999 92.3 290.50.060.23.31.52.71.996.362.8VAy=0.424 7x-0.060 80.999 90.679.60.040.13.03.23.63.2100.802.4HAy=0.435 8x-0.003 30.999 90.679.20.030.1-注：“-”表示所测成分低于 LOD。图 2不同批次水蛭中短链脂肪酸总含量柱状图与短链脂肪酸相对含量热图注：A：空白溶剂，B：水蛭样品-无内标物，C：水蛭样品-含内标物，D：混合对照品溶液；1：乙酸，2：丙酸，3：异丁酸，4：丁酸，5：异戊酸，6：戊酸，7：己酸，IS1：2-乙基丁酸，IS2：2-乙基己酸。图 1短链脂肪酸含量气相色谱图105天 津 中 医 药 大 学 学 报Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine第 42 卷第 1 期2023 年 2 月Vol42No1Feb2023水蛭样品供试品溶液的制备方法，考察了水蛭样品与提取溶剂料液比（0.2：10、0.2：25、0.2：50 g/mL）、不同浓度乙醇溶液（25%、50%、75%、100%）、不同超声时间（0、5、10、20 min）对于水蛭样品中各指标成分的影响，结果显示采用 25%乙醇作为提取溶剂，以料液比 0.210 超声提取 10 min 时各指标成分提取效率最高，色谱峰峰形较好。4.2水蛭中短链脂肪酸的合成及在心血管疾病治疗中的意义在测定不同水蛭样品中的短链脂肪酸时，发现水蛭中乙酸与丙酸的含量较高，而其他短链脂肪酸含量较低。肠道微生物的组成影响短链脂肪酸的类型与数量。文献报道水蛭肠道中主要包括类理研菌、气单胞菌，此外还有少量的拟杆菌21，类理研菌可将黏蛋白多糖分解为乙酸20，拟杆菌可以通过琥珀酸途径生成丙酸，推测水蛭中的丙酸主要由拟杆菌产生22。研究表明短链脂肪酸在心血管疾病的预防与治疗中发挥重要作用，其中乙酸可以维持肠黏膜的完整性而减少外周血管中脂多糖的浓度，并能抑制心脏纤维化从而改善心脏功能23；丙酸盐可以减小动脉粥样硬化斑块，还能激活肾脏和血管平滑肌中的 G 蛋白偶联受体 41（Gpr41）发挥降压作用24。此外，丁酸等其他短链脂肪酸具有抗炎、降压、调节免疫的作用。通过饮食补充乙酸、丙酸、丁酸可以减缓高血压病、心肌肥厚纤维化的发展25。综上所述，水蛭中以乙酸、丙酸为主的短链脂肪酸可能是治疗心血管疾病重要的药效物质。本研究基于气相色谱法建立了快速、稳定、重复性良好的水蛭中短链脂肪酸的含量测定方法，为进一步研究水蛭的药效物质基础以及全面控制水蛭质量提供数据支撑。参考文献：1顾观光.神农本草经M.杨鹏举，校注.北京：学苑出版社，2007.GU G G.Shennong s herbal classicM.YANG P J，edit.Beijing：academy press，2007.2国家药典委员会.中华人民共和国药典M.北京：中国医药科技出版社，2020.National Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of thePeople s Republic of China M.Beijing：China Science andTechnology Press，2020.3SCHORN T，DRAGO F，TETTAMANTI G，et al.Homolog ofallograft inflammatory factor-1 induces macrophage migra-tionduringinnateimmuneresponsein leechJ.Cell and Tis-sue Research，2015，359(3)：853-864.4KVIST 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Tianjin University of Traditional Chinese Medicine第 42 卷第 1 期2023 年 2 月Vol42No1Feb2023Rapid determination of short chain fatty acids in leech by gas chromatographyHUANG Fei，LI Lingyun，YU Huijuan，WANG Yuefei，CUI Ying，CHAI Xin（State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine，Tianjin Key Laboratory of Traditional ChineseMedicine Chemistry and Analysis，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）Abstract：Objective A quantitative analysis method was established for determination of short chain fatty acids（SCFAs）（acetic acid，propionic acid，butyric acid，isobutyric acid，valeric acid，isovaleric acid，and hexanoic acid）in leech by gas chromatography.Methods The content of seven SCFAs in leech samples was determined by gaschromatography with 2-ethylbutyric acid and 2-ethylhexanoic acid as internal standards.The components wereseparated by DB-FFAP elastic quartz capillary column（30 m0.25 mm0.25 m）by programmed rise of temperature，which were detected by hydrogen flame ionization detector.The temperature of inlet and FID detector was fixed at240 C，respectively.The high purity nitrogen was employed as carrier gas（1.0 mL/min）and make-up gas（25 mL/min）respectively.Results The content of SCFAs from different batches leech was obviously different，and the totalcontent of SCFAs was distributed from 1 101 to 8 571 g/g.Furthermore，the content of acetic acid，propionic acid，isobutyric acid，valeric acid，isovaleric acid，and hexanoic acid was 783.03 479，246.75 166，087.73，073.02，0112.8，065.65 g/g，respectively.Conclusion The method established in this study for the determination ofSCFAs in leech is simple，rapid and stable，which can provide basis for the quality control of leech.Keywords：leech；short chain fatty；gas chromatographyMA L，MA L，WANG S B，et al.Review on scientificconnotation of leech processed under high temperatureJ.China Journal of Chinese Materia Medica，2015，40(19)：3894-3898.14 沈仕伟，邸莎，韦宇，等.水蛭临床应用及其用量J.吉林中医药，2019，39(3)：313-316.SHEN S W，DI S，WEI Y，et 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