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浅论复合导管修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究
【摘要】 目的 翻转静脉为内层、壳聚糖导管为外层组成复合神经导管，透明质酸钠凝胶为细胞外基质并加入神经生长因子，构成新型组织工程化人工神经，桥接大鼠坐骨神经缺损，观察其对神经再生的作用。方法 取24 只成年雄性SD大鼠随机分为4 组，建立大鼠坐骨神经缺损10 mm的动物模型，分别用复合导管(翻转静脉与壳聚糖)加神经生长因子，翻转静脉加神经生长因子，壳聚糖导管加神经生长因子和自体神经修复大鼠右后肢坐骨神经约10 mm的缺损。术后12 w进行形态学(光镜、透射电镜、免疫组织化学、轴突图像分析)和神经电生理学(运动神经传导速度、复合肌肉动作电位)检测。结果 纳入大鼠 24 只，均进入结果分析。①术后12 w时，对于各项形态学指标，A组与D组接近，差异无统计学意义;但A组优于B组、C组，差异有统计学意义()。②电生理指标：术后12 w时，A组坐骨神经平均传导速度明显高于B组、C组，但低于D组，差异有统计学意义()。A组平均动作电位幅度与自体神经移植组接近，优于B组、C组，差异有统计学意义()。③术后12 w时，A组腓肠肌湿重恢复率接近于D组，明显优于B组、C组，差异有统计学意义()。结论 以翻转静脉为内层、壳聚糖导管为外层组成复合神经导管，透明质酸钠凝胶为细胞外基质并加入神经生长因子，构成新型组织工程化人工神经，为神经缺损修复创造良好微环境，可明显促进神经再生。
【关键词】 复合导管;翻转静脉;壳聚糖导管;神经缺损
　　Abstract： Objective This experimental study is to construct the tissue-engineered artificial nerve mixed with composite conduit， sodium hyaluronate gel matrix and NGF， and evaluate the effectiveness for bridging rat sciatic nerve　By establishing 24 models of 10 mm sciatic nerve defect， randomly divided into four groups. The sciatic nerve defects were repaired by tissue-engineered artificial nerve or autogenous nerve. In Group A， NGF was mixed with sodium hyaluronate gel matrix and composite conduit for nerve defect，in group B， NGF was mixed with sodium hyaluronate gel matrix and inside-out vein graft for nerve defect，in group C， NGF was mixed with sodium hyaluronate gel matrix and chitosan conduit for nerve defect，in group D， autograft. After 12 weeks， the regenerating nerve was checked by morphology (light microscope， transmission electron microscope (TEM)， immunohistochemistry， axon image-analysis) and electrophysiology (mean conduct velocity and action potential of sciatic nerve).Results All the 24 rats were involved in the result analysis. (1) In the twelfth week， as for morphology， each index of the group A was not different from the autograft group and better than the group B and C. (2) In the twelfth week，as for the results of electrophysiology， the mean conductive velocity of sciatic nerve in the group A was faster than that of group B and C， but lower than that of the group　action potential amplitude of group A was nearly equal to that of group D and significantly higher than that of group B and C. (3) In the twelfth week， the mean green-weight (wet weight) percentage in the group A was nearly equal to that of group D， but was higher than that of group B and C. Conclusions Inside-out vein graft as the inner layer and chitosan conduit as the outer layer form composite conduit， and sodium hyaluronate gel matrix and NGF form new typal tissue-engineered artificial nerve. This artificial nerve can obviously promote the nerve regeneration.
　　Key words： composite conduit; inside-out vein graft; chitosan conduit; nerve defect
　　周围神经缺损的治疗一直是临床工作中的一个难题。自体神经移植目前仍然是治疗周围神经缺损的主要方法，也是评价其他治疗方案的“金标准”。但自体神经无法满足目前的临床需要。随着生物工程技术的发展，目前已应用组织工程技术构建了人工神经导管，为修复长段神经缺损提供了新的方法和思路。将翻转静脉与壳聚糖导管有机结合，翻转静脉作为导管内层，壳聚糖作为导管外层，通过透明质酸钠将神经生长因子整合于导管内，制备成新型组织工程化人工神经，修复大鼠坐骨神经缺损，观察其对神经再生的作用，为临床应用奠定基础。
　　1 材料与方法
　　实验动物、地点及分组
　　李爽，等：复合导管修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究辽宁医学院学报 2010年8月，31(4)健康成年雄性SD大鼠24 只，体重250～300 g。由中国医科大学实验动物中心提供。按随机数字表法分为4组：A组、复合导管+透明质酸钠凝胶+NGF;B组、翻转静脉+透明质酸钠凝胶+NGF;C组、壳聚糖导管+透明质酸钠凝胶+NGF;D组、自体神经移植。于二零五医院显微外科实验室完成实验。
　　翻转静脉与壳聚糖复合导管的制备
　　麻醉后，无菌条件下取出大鼠右侧颈外静脉约15 mm长。静脉段取出后，将一把显微镊之尖端自静脉段之近端管口伸入管腔直至远侧管口，夹持少许管口组织，两镊向相反方向缓缓牵拉即可将静脉段翻转，备用。将取出并翻转的静脉一端结扎，并套入一圆头、直径 mm的克氏针;取10 mm长壳聚糖管，将外套静脉的克氏针连同静脉一同插入壳聚糖管，抽出克氏针，剪断盲端约2 mm，剩余静脉长度约13 mm长，两端露出壳聚糖管各约 mm，制成复合导管。
　　手术方法
　　麻醉后，无菌条件下制作大鼠右侧坐骨神经缺损10 mm模型。A、B、C组将神经两断端分别置入复合导管、翻转静脉及壳聚糖导管内，用11-0无创缝线各缝合固定2 针，使神经两断端在各个神经导管内相距10 mm。用一次性无菌注射器向A、B、C组导管中注入包裹NGF的透明质酸钠凝胶。D组将切取下10 mm的坐骨神经反转，断端直接缝合，做自体神经移植。
　　观察指标
　　术后4、8、12 w计算坐骨神经指数(SFI)。术后12 w检测坐骨神经动作电位幅度(AP)和传导速度(MCV)，测量大鼠双后肢腓肠肌湿重，计算腓肠肌湿重恢复率，行HE染色、免疫组化染色及透射电镜观察。
　　统计学处理
　　所有数据用均数±标准差来表示，统计软件进行方差分析及两两比较。
　　2 结 果
　　坐骨神经指数(见表1)。表1 4、8、12 w各组 SFI结果(n=6，-(-I)±s)注：﹡与A组相比P=;﹡﹡与A组相比P=;#与A组相比P=;##与A组相比P=
　　电生理检测
　　术后12 w检测坐骨神经传导速度和动作电位幅度，见表2。表2 电生理检测结果(n=6，-(-理)±s)注：﹡与A组相比P=;﹡﹡与A组相比P=;#与A组相比P=;##与A组相比P=
　　腓肠肌湿重恢复率
　　术后12 w切除大鼠两侧的腓肠肌，对比实验侧肌肉萎缩恢复情况。各组肌肉都有不同程度萎缩，但都较损伤早期有恢复，见表3。表3 术后12 w腓肠肌湿重恢复率(%)(注：﹡与A组相比P=;#与A组相比P=
　　HE染色观察
　　术后12 w再生的坐骨神经HE染色组织切片显示，各组再生神经全部长入远端。A组、D组再生神经纤维排列整齐度、密集度以及新生血管数量均明显优于B组和C组(图1～4)。
　　S-100免疫组织化学染色观察
　　横切片显示：A组、D组再生神经可见S-100免疫反应阳性的雪旺氏细胞数量较多，分布密集，排列整齐，明显优于B、C组(图5～8)。
　　有髓神经纤维数目及直径
　　见表4。
　　表4 图像分析有髓神经纤维数目及直径结果注：﹡与A组相比P=;﹡﹡与A组相比P=;#与A组相比P=;##与A组相比P=
　　透射电镜超微结构观察
　　术后12 w透射电镜观察：A组、D组再生的神经纤维较粗大，呈圆形或椭圆形，形态规则，排列紧密，髓鞘厚度较厚，轴突结构完整。B组相对而言，再生神经纤维细小，形状不规则，髓鞘厚度较薄;C组再生神经纤维最细小，各条神经纤维大小不一，排列疏松，轴突结构不完整(图9～12)。
　　3 讨 论
　　翻转静脉为内层、壳聚糖为外层的复合神经导管在神经再生中的作用
　　随着材料学的发展，各国学者相继制作了生物不可降解材料、生物可降解合成材料、天然生物材料等不同的神经导管，进一步把种子细胞和神经营养因子引入导管构成组织工程化人工神经，模拟神经再生的微环境，促进神经再生。
　　静脉导管是生物型神经导管的代表。静脉管壁薄，利于营养物质弥散，也利于神经趋化物质发挥作用。其组织结构与神经外膜相似，血管内皮细胞的基底膜又类似于神经基底膜，非常有利于神经再生。Williams等曾证明无神经支配的血管具有趋化神经再生的作用，并认为这种作用与其上的雪旺细胞有关。构建组织工程化神经的一个重要组成部分是种子细胞，最重要的种子细胞是雪旺细胞。静脉表面有大量的交感神经纤维网，雪旺细胞位于神经外膜。静脉段取出后处于失神经支配状态，其上的雪旺细胞将发生活化、增殖、分泌等一系列变化。翻转静脉可以起到置入雪旺细胞的作用，且静脉外膜富含胶原成分，可以促进基质桥的形成，加速神经再生。
　　壳聚糖是一种多聚糖，不仅具有良好的物理、化学、机械性能，还具有很好的生物相容性、可降解性、免疫抗原性小、无毒性等特殊的生物医学特征。壳聚糖对神经组织无不良影响，因而在构建神经支架方面应用广泛。壳聚糖能抑制成纤维细胞的生长，减少瘢痕的形成，同时能促进内皮细胞的生长。此外，壳聚糖有利于血管的发生，在神经修复中为再生的轴突提供营养。Rosales等研究结果显示，壳聚糖可以作为神经导管材料用于损伤的周围神经修复，并且不会引起机体排斥反应。
　　Raimondo等报道采用自体静脉与骨骼肌复合的导管修复缺损1 cm的鼠坐骨神经，能够维持雪旺细胞的迁移和增殖，但其机械强度差，并且肌肉组织来源有限。静脉组织相容性好，又类似神经基底膜，有利于神经轴突生长，而且内置自身的雪旺细胞，解决了雪旺细胞体外增殖及植入等一系列难题。但静脉管壁薄，机械强度差，自身有塌陷趋势。作为神经导管材料时，受到周围组织压迫，使静脉导管处于塌陷或狭窄状态，影响了神经再生。为了克服静脉导管的外在压力，本实验在翻转静脉外套接壳聚糖导管，增加导管强度，使静脉导管不会因外在压力而塌陷，并随着神经纤维生长，壳聚糖导管逐渐降解。
　　术后12 w，A组SFI测定值、坐骨神经动作电位幅度和传导速度、腓肠肌湿重恢复率、再生神经有髓神经纤维数目及直经及光镜、透射电镜显示再生神经状况均优于B、C组，提示翻转静脉为内层、壳聚糖为外层的复合导管，可作为支架材料，效果优于静脉或壳聚糖导管。
　　复合导管、透明质酸钠及NGF构成的组织工程化人工神经在周围神经损伤修复中的作用
　　人工神经研究的主要内容是将雪旺细胞或具有雪旺细胞功能的细胞种植在具有生物相容性、可吸收性、半通透性并能提供理想的细胞及神经纤维界面的神经导管内，通过载体持续释放神经营养因子，来桥接周围神经缺损。本实验以翻转静脉为内层、壳聚糖导管为外层构成复合导管，以翻转静脉上的雪旺细胞为种子细胞，以透明质酸钠凝胶为细胞外基质并加入NGF，构成人工神经。导管内层的翻转静脉类似神经基底膜，并能提供雪旺细胞，导管外层的壳聚糖可有效缓解内层静脉导管所受外在压力，并且随着神经再生而逐渐降解;透明质酸钠凝胶作为细胞外基质可缓释NGF，并能够支撑内层静脉导管;NGF可促进周围神经再生。此组织工程化人工神经模拟生理环境，各部相互作用，构成有机统一体。修复大鼠坐骨神经缺损，SFI值、坐骨神经动作电位幅度和腓肠肌湿重恢复率、再生神经纤维数目及直径、S100免疫组织化学染色接近于自体神经移植组，虽然传导速度较自体神经移植组略慢，但明显优于其他两组由单纯导管制备的组织工程化人工神经。表明本实验构建的组织工程化人工神经可促进神经生长，修复周围神经短距离缺损是有效的。本实验为复合导管的制备及组织工程化人工神经的组成提供了新的思路。
【参考文献】
　　[1] 顾玉东.周围神经缺损的基本概念与治疗原则.中华手外科杂志，2002,18(3)：129-130.
　　Fakoya FA，Caxton-Martins　neurodegeneration in young adult Wistar rats prenatally exposed to　Teratol,2006,28(2)：229-237.
　　Tabakoff B，Hoffman　models in alcohol　Res Health,2000,24(2)：77-84.
　　Origlia N，Capsoni S，Domenici L，et　window in cholinom imetic ability to rescue long-term potentiation in neurodegenerating antinerve growth　Alzheiners Dis,2006,9(1)：59-68.
　　Williams　aorta isografts possess nerve regeneration-promoting properties in silicone Y　Neurol,1987,93(6)：555-563.
　　Rosales CM，Peregrina　Study of a Chitosan Prosthesis in the Sciatic Nerve Regeneration of the Axotomized　Biomater Appl,2003,18：15-23.
　　Raimondo S， Nicolino S， Tos P， et　cell behavior after nerve repair by means of tissue-engineered muscle-vein combined　Comp Neurol， 2005， 489(2)： 249.