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浅论壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞的抑制作用
【摘要】 目的： 观察壳聚糖对白血病细胞的作用。方法： 以不同浓度的壳聚糖处理白血病细胞K562后，运用RTPCR方法检测实验组K562细胞中多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2mRNA表达差异。另用不同浓度的壳聚糖分别作用于白血病K562细胞和SHI1细胞，MTT法检测壳聚糖对两种细胞的相对抑制率。结果： 与阴性对照组比较，实验组K562细胞的ppGalNAcT2表达降低，且随壳聚糖浓度升高，表达量进一步减少；MTT实验显示不同浓度的壳聚糖对K562细胞和SHI1细胞均有抑制作用，并呈浓度依赖性。结论： 壳聚糖对肿瘤细胞有一定的抑制作用，同时还可以减少ppGalNAcT2在mRNA水平的表达。
【关键词】 多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2； 壳聚糖； RTPCR； 白血病细胞
　　［Abstract］ Objective: To observe the effect of chitosan on leukemia cells(K562,SHI1).Methods： The leukemia cells were treated by different concentration of chitosan. The expression of ppGalNAcT2 on K562 cells were determined by RTPCR method. The leukemia cells were treated by different concentration of chitosan， and the relative inhibition rate was determined by MTT assay. Results： With adding the chitosan to compare with the negative group, the expression of ppGalNAcT2 in the experimental group K562 cells reduced, and had the inverse ratio with the chitosan′s concentration. In the MTT assay, the chitosan with various concentrations had the inhibitory action on the K562 cells and the SHI1 cells. Conclusion： The chitosan suppressed the K562 cells and the SHI1 cells multiplication, and its action advanced along with the concentration. Chitosan influenced the expression of ppGalNAcT2 in leukemia cell K562 reduced its expression quantity.
　　［Key words］ ppGalNAcT2; chitosan; RTPCR; leukaemia cell
　　壳聚糖［化学名：βN乙酰D葡萄糖胺］是甲壳素经脱乙酰化得到的产物，又名甲壳胺、脱乙酰壳多糖等，是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在体内能被溶菌酶等降解，降解产物能完全被人体吸收，无毒副作用［1］。近年研究表明壳聚糖及其衍生物有抗肿瘤和增强机体免疫功能作用。杜昱光等［2］发现壳寡糖在体外可抑制肝癌、宫颈癌、白血病和S180腹水癌等多种癌细胞的生长，并抑制肿瘤细胞的DNA合成，在体内壳寡糖可抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长其生存期。本实验以慢性髓源性白血病细胞K562的多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2作为研究对象，对不同浓度壳聚糖作用48 h后的白血病细胞ppGalNAcT2的mRNA表达变化进行探索，同时利用MTT法检测壳聚糖对K562和急性单核细胞白血病细胞SHI1的相对抑制率，为壳聚糖作为抗肿瘤辅助药物提供依据。
　　1 材料与方法
　　材 料

　　壳聚糖胶囊由中科院大连化学物理研究所馈赠，RPMI1640培养基为美国Gibco产品，Taq DNA聚合酶,dNTP MIX为MBI公司产品，MTT购自Sigma公司，PCR仪为美国MJ产品，酶联免疫检测仪为BioTek产品。
　　壳聚糖的配制

　　从壳聚糖胶囊中获得壳聚糖，用无血清培养基配成相应浓度。
　　细胞的培养与处理

　　白血病细胞SHI1由苏州大学附属第一人民医院血液研究所提供，K562细胞由本教研室复苏后常规培养检测ppGalNAcT2表达
　　反转录cDNA反应体系 ①六碱基随机引物 1 μl；ddH2O12 μl；25℃×10 min预热；②细胞株RNA 5 μl；dNTP MIX 1 μl；上下颠倒混匀并离心，65℃×5 min；③迅速置于冰上至少1 min，再加入5×firstband 缓冲液 5 μl；反转录酶1 μl；上下颠倒混匀并离心，42℃×50 min，70℃×20 min，37℃×20 min后进行PCR反应。
　　扩增PCR反应体系 10×PCR 缓冲液5 μl；MgCl2(25 mmol/L) 3 μl；dNTPs(10 mmol/L)1 μl；Taq E(5 U/μl)　μl；引物1+1 μl；上述反转录生成的cDNA 2 μl；无RNase ddH2O　μl；反应条件： 94℃预变性 5 min，94 ℃变性 45 s，55 ℃退火 50 s，72 ℃延伸1 min。35个循环,72 ℃再延伸 7 min。
　　%琼脂糖凝胶电泳

　　RTPCR扩增产物20 μl与上样缓冲液4 μl混合上样，与pUC MIX DNA 标准参照物一起在%琼脂糖凝胶上电泳分离。在1×TAE电泳缓冲液中100 V恒电压电泳45 min，溴化乙啶染色，UVP图像分析仪摄像并分析结果。
　　MTT比色法

　　实验在96孔塑料培养板中进行，K562细胞和SHI1细胞以浓度为1×105/ml铺板。阴性对照组以培养基代替药物；实验组药物终浓度为50，100，200，400，800 μg/ml。每组设3个复孔，设3个空白调零孔。常规培养，于44 h加入MTT，继续培养4 h，加入SDS/HCl终止反应，并于37℃放置约4 h，使结晶溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测光密度，计算3个孔D的平均值，按下式计算不同浓度壳聚糖对细胞的抑制率。
相对抑制率=阴性对照组D值-实验组D值阴性对照组D值×100%
　　2 结果
　　壳聚糖对K562细胞中ppGalNAcT2表达的影响

　　从条带的亮度可以看出，阴性对照组的ppGalNAcT2表达量最高，加入壳聚糖后表达降低，且随药物浓度增加，表达逐步减弱。软件计算ppGalNAcT2与内参βactin条带亮度的相对值，得到ppGalNAcT2的相对表达柱形图，随着壳聚糖浓度的升高，ppGalNAcT2的表达量明显下降。

　　1～4：壳聚糖浓度依次为0，50，100和200 μg/ml；M：标准参照物
　　图1 K562细胞ppGalNAcT2的表达
　　Fig 1 Expression of ppGalNAcT2 on K562
　　壳聚糖对K562细胞增殖的相对抑制率

　　壳聚糖在体外能抑制K562细胞的生长。低浓度壳聚糖对细胞的抑制作用不明显，低于200 μg/ml浓度时其对细胞的抑制率小于10%，但随着壳聚糖浓度的升高，细胞的生长抑制率迅速升高，当壳聚糖浓度为800 μg/ml时有多数细胞生长明显受到抑制，抑制率达%。

　　1～4：壳聚糖浓度依次为0,50,100和200 μg/ml
　　图2 K562细胞T2的相对表达
　　Fig 2 Relative expression of ppGalNAcT2 on K562
　　图3 壳聚糖对K562细胞的抑制作用
　　Fig 3 Inhibition effect of chitosan on K562
　　壳聚糖对SHI1细胞增殖的相对抑制率

　　壳聚糖在体外同样能抑制SHI1细胞的生长。低浓度壳聚糖对细胞生长抑制作用不明显，但随浓度升高抑制率迅速升高。浓度在200 μg/ml时，抑制率为%，而当浓度达800 μg/ml时抑制率为%。相对于K562细胞，壳聚糖对SHI1细胞的抑制作用较弱。

　　图4 壳聚糖对SHI1细胞的抑制作用
　　Fig 4 Inhibition effect of chitosan on SHI1
　　3 讨论

　　肿瘤细胞中的糖蛋白糖链结构异常与肿瘤的生物学行为，如恶性转化、转移和浸润等密切相关，而糖链结构异常的基础是糖基转移酶的变化［4］。因此，研究肿瘤细胞的糖基转移酶表达差异，有助于了解肿瘤的生物学行为机制。通过研究浸润性不同的白血病细胞株的糖基转移酶表达差异，有助于揭示糖基转移酶与白血病细胞株浸润能力的关系，从而为从糖生物学角度治疗白血病提供思路。

　　白血病是一种造血组织的恶性疾病，俗称“血癌”，是某一类型的白血病细胞在骨髓或其他造血组织中的肿瘤性增生，可浸润体内各器官、组织，使各个脏器的功能受损，产生相应的症状和体征。糖基化是真核细胞蛋白质转录后修饰方式中的一种。这些糖蛋白与一系列的生物学功能有着广泛的联系，如细胞间的黏附，自我与非自我的识别，分子运输与清除，受体激活，细胞的内吞作用等。某些糖基转移酶活性升高或降低,就会产生癌变，故一些糖基转移酶活性被视为癌变的重要标志［５］。本实验用RTPCR方法检测壳聚糖作用于K562细胞后ppGalNAcT2的mRNA表达变化，ppGalNAcT2在未处理组K562细胞中表达较高，随着加入壳聚糖浓度的提高，表达量逐渐降低。结果表明壳聚糖可抑制白血病细胞K562的ppGalNAcT2表达。

　　甲壳素作为一种天然的碱性多糖，具有抗癌作用。实验证明，特别是甲壳素六聚糖具有很强的抑制肿瘤作用，它通过增强机体非特异性免疫对肿瘤有抑制作用，其机制是促进巨噬细胞活性，作用途径是影响非杀伤性细胞活性IL2的分泌［6］。本实验采用MTT法，用不同浓度壳聚糖作用于白血病细胞K562，SHI1，于48 h后检测D值，发现随壳聚糖浓度升高，其对细胞的抑制率逐渐增加。但在低浓度时有波动，可能由于实验是微量操作，细胞浓度和加样量的极微差异都会导致实验结果的波动。实验结果显示壳聚糖对细胞有抑制作用，但对低浓度壳聚糖的抑制作用，还需调整实验中多糖浓度进一步研究。

　　通过本次实验发现壳聚糖对白血病细胞K562和SHI1都有抑制作用，其机制可能是带阳离子的壳聚糖，直接作用于带负电荷比正常细胞多的肿瘤细胞，从而抑制了实验中两种细胞的生长。但也不排除其他的可能。近年来,研究发现细胞凋亡的异常在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用,许多抗肿瘤药物都是通过诱导细胞凋亡而发挥其作用。新近研究表明壳聚糖也具有诱导细胞凋亡的作用，Hasegawa等［7］研究发现壳聚糖可诱导膀胱癌细胞凋亡,从而抑制其增殖。肿瘤细胞的凋亡受许多因素的影响,其中癌基因、抑癌基因、细胞因子在其中起着重要作用。因此,诱导肿瘤细胞凋亡也可能是壳聚糖抑制肿瘤细胞生长的重要机制。

　　多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化O聚糖合成的第一步反应，将UDPGalNAc上的GalNAc基团转移至蛋白多肽链上特定序列中的Thr或Ser从而合成GalNAcαOSer/Thr。ppGalNAcT及其家族作为黏蛋白O糖基化的起始酶，在一些蛋白质上，OGlcNAc和O磷酸化相互竞争同一或邻近的位点［8］，可能与肿瘤的生长和转移，细胞的信号传导等密切相关。肿瘤细胞表面可有类似黏蛋白的糖蛋白，含有丰富的O糖基化结构域，在肿瘤的转移和浸润生长过程中黏蛋白起着重要的作用，ppGalNAcT可能通过各种途径调节细胞的生长及浸润转移，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。通过本次实验结果，初步推测壳聚糖降低白血病细胞K562的糖基转移酶ppGalNAcT2的表达，同时ppGalNAcT2的表达降低可能影响K562细胞的生长与转移浸润，使细胞的生长受到抑制，正如MTT试验结果显示，加入壳聚糖后细胞生长受到不同程度的抑制。但白血病细胞K562的糖基转移酶ppGalNAcT2表达的降低与细胞增殖受到抑制，这两者之间是否存在某种联系，还需进一步实验研究探讨。
【参考文献】
　　［1］ Angnihotri SA,Mallikarjuna NN,Aminabhavi TM. Recent advances on chitosanbased micro and nanoparticles in drug delivery ［J］. J Control Re1ease,2004, 100(1) : 5-28.
　　［2］ 杜昱光, 白雪芳, 金宗濂, 等. 壳寡糖抑制肿瘤作用的研究［J］. 中国海洋药物, 2002, 21(2) : 18-21.
　　［3］ 仇 灏, 陈克平, 周嘉梁，等. Northern杂交检测多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2在不同肿瘤细胞中的表达水平［J］. 江苏大学学报：医学版, 2005, 15(1) : 14-16.
　　［4］ 赵 凝, 杨 静, 郭向红，等. 全反式维甲酸对SHI1细胞株糖基转移酶表达的影响［J］. 江苏大学学报：医学版, 2005, 15(6) : 465-469.
　　［5］ Ohtsubo K, Marth JD. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease ［J］. Cell，2006, 126: 855-867.
　　［6］ 玉顺子. 甲壳素及其衍生物药理作用的研究进展［J］. 时珍国医国药, 2006, 17(10) : 2072-2073.
　　［7］ Hasegawa M, Yagi K, Iwakawa S, et al. Chitosan induces apoptosis via caspase3 activation in bladder tumor cells［J］. Jpn J Cancer Res, 2001, 92(4) :459-466.
　　［8］ Hart GW, Housley MP,Slawson C. Cycling of Olinked betaNacetylglucosamine on nucleocytoplasmic proteins. ［J］. Nature，2007, 446: 1017-1022.