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EGCG对人耐药口腔表皮样癌细胞株耐药逆转的实验【摘要】 目的 研究EGCG对人多药耐药口腔癌细胞KBV200的细胞毒增敏作用及裸鼠移植瘤的抑瘤作用。方法 MTT法检测药物对细胞的毒性作用，流式细胞术分别检测细胞P糖蛋白的表达， HPLC检测细胞内VCR浓度，采用KB和KBV200细胞分别种植同一裸鼠左、右腋下，观察用药后体重、抑瘤率的改变。RTPCR检测瘤组织mdr1的表达。结果 EGCG在100mgL-1以下剂量对两株肿瘤细胞的抑制率均小于10%，EGCG与VCR联合应用可明显提高VCR的细胞毒作用；EGCG联合VCR作用后KBV200细胞内VCR浓度升高，P糖蛋白的表达下降；EGCG可增加VCR对KBV200的抑瘤作用， 可降低瘤组织MDR1的表达量。结论 EGCG可增强VCR对多药耐药肿瘤细胞KBV200的细胞毒作用，机制可能与降低MDR1mRNA、Pgp表达，提高细胞内药物浓度有关。【关键词】 多药耐药；P糖蛋白；耐药逆转剂；鳞癌0 引言 口腔癌在世界范围内高发，居头颈部肿瘤第二位，是十大最低患者生存率肿瘤之一，原发多药耐药(Multidrug resistance，MDR)及继发MDR较为严重，常见机制是MDRl、LRP(Lungresistance related protein,LEP)、MRP1(Multidrug resistance related protein,MRP)表达升高，导致相应胞膜或核膜蛋白表达增高1。如何解决以鳞癌、肝癌等为代表的实体瘤MDR问题是当前抗肿瘤研究的热点。目前MDR逆转剂多数为P糖蛋白功能抑制剂，如维拉帕米，临床上的VRP最大耐受浓度为2mol/L,这一浓度在体外组织培养中不能逆转MDR，限制了临床的使用。到目前为止，二、三代多药耐药逆转剂尚未成功应用于临床。因此在天然药物中寻找高效、低毒RRA或改造已知RRA的化学结构以降低其毒性是主要研究方向。国内外研究绿茶提取物，特别是EGCG的抗肿瘤和逆转MDR作用，研究集中于逆转机制与MDR1或MRP1的关系，部分结果表明EGCG可通过抑止Pgp功能发挥逆转作用，而部分资料显示其逆转作用独立于Pgp和MRP2，体内实验较缺乏；我们前期已证实EGCG在体外可逆转人MDR肝癌细胞BEL7404/ADR的MDR作用1。本研究探讨EGCG体内逆转KBV200的MDR作用，为进一步发现新的多药耐药逆转剂和可能的作用靶点提供实验依据。 1 材料和方法细胞与动物 人口腔表皮样癌细胞株KB和KBV200由北京大学临床肿瘤学院许佐良教授惠赠。BALB/Cnu/nu裸小鼠，体重g，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物公司，饲养于SPF条件下。 药物及试剂 盐酸长春新碱购于上海华联制药有限公司； EGCG按专利CN1060488A分离得； MTT购自Sigma，RPMI1640、新生牛血清购自GIBCOBRL；抗PgpPE抗体: Becton Dickinson；小量组织总RNA快速抽提纯化试剂盒购自北京华舜；First strand cDNA synthesis kit、MassRulerTM DNA Ladder购自MBI。 方法细胞培养用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液于37、饱和湿度、5% CO2环境中培养KBV200培养液中含有200nmolL-1VCR以维持耐药性，用%胰蛋白酶联合% EDTA消化传代。耐药倍数测定对数生长期细胞，制成105 ml-1悬液，每孔100l接种于96孔板，加入相应浓度的含药培养液，参照文献，用酶联免疫检测仪检测波长570nm处的吸光度。细胞存活率100%。由细胞存活率与药物浓度作图，求出IC50值。逆转倍数逆转前耐药细胞IC50/逆转后耐药细胞IC50。MTT试验在不同日重复3次。高效液相色谱检测细胞对VCR的转运细胞对VCR的被动转运用含15mM叠氮化钠、10mM 脱氧葡萄糖和10 NBS的PBS(pH )处理细胞15min，换用含/L的VCR、或又含EGCG 8mg/L的上述培养液孵育2h，冷PBS洗涤3次，用冷三蒸水，-20反复冻融3次，取上清做HPLC分析。色谱条件及数据处理等详见文献。细胞对VCR的摄入和外排参照文献，细胞接种于24孔培养板，待长满孔板，用含10mM葡萄糖和10 NBS的PBS培养1h，换为相应培养液2h，冷PBS洗涤3次， 同样方法检测VCR浓度；单层细胞用8mg/L EGCG的培养液处理1h，换用相应含VCR培养液处理2h， PBS洗涤1遍，换为不含VCR，只含EGCG的培养液，培养至指定时间，收获细胞，同样方法检测VCR含量。流式细胞仪检测Pgp表达按分组给药消化各组细胞,制备106 ml-1浓度的细胞悬液,取5l抗PgpPE加入50l细胞悬液中,充分混匀,室温避光孵育30min后,PBS洗涤,加入 1%多聚甲醛混匀,上机检测488nm激发波长下的荧光强度。裸小鼠异种移植瘤动物模型的建立24只裸小鼠，取对数生长期KB、KBV200细胞制成5107 ml-1，各取分别接种于裸小鼠左、右侧腋窝皮下，第4天见皮下肿瘤生长，两株细胞出瘤率均100。分组：雌雄各半，随机分组：对照组、VCR组、EGCG组、EGCG联合VCR组，两种移植瘤分别用KB(对照组、VCR组、EGCG组、V E组)，KBV(对照组、VCR组、EGCG组、V E组)代表，于接种后第8天,KB肿瘤体积平均为cm3,KBV200肿瘤体积平均为cm3,开始用药。EGCG 20mgkg-1,一日一次; VCR kg-1，四日一次，均腹腔注射。每隔一天测量肿瘤最长径(L)和其垂直径长(D),按下式计算肿瘤体积(V):V=/6LD2，观察至给药14天结束。颈椎脱臼致死，取瘤组织，称瘤重，计算抑瘤率，抑瘤率( IR) = (1实验组平均瘤重/ 对照组平均瘤重) 100 %。PCR检测多药耐药基因的表达提取瘤组织总RNA,逆转录为cDNA,取1l cDNA，按说明建立20l的体系，PCR扩增引物及条件：MDR1参照文献， LRP及MRP 1参考文献，产物长度分别为157bp,285bp,256bp; actin上游引物AAG CAG GAG TAT GAC GAG GAT CCG,actin下游引物GCC TTC ATA CAT CTC AAG TTG G,产物559bp。产物于2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描成像，Quantity one软件分析产物光密度值，用目的基因与actin的比值表示相应基因的表达水平。统计学分析数据以s表示，用进行Student t检验或析因设计方差分析。2结果对肿瘤细胞增殖的影响 药物作用后细胞存活率见表1，作用72h KBV200的IC50为()mg/L，KB的IC50为/L，KBV200的耐药倍数为53倍。30mg/L的EGCG联合/L VCR处理后，检测KBV200的IC50为()mg/L；而/L的维拉帕米联合不同浓度VCR处理后,KBV200的IC50为()mg/L,逆转倍数分别为倍和倍，二者相比有统计学意义。表1 EGCG和VCR对两种肿瘤细胞的细胞毒性作用(略) 对KB和KBV200细胞以及对VCR转运的影响 在含叠氮钠的培养条件下，VCR在 KB和KBV200细胞内的浓度分别为()ng和()ng，无显着差异， EGCG对VCR在细胞内的浓度没有影响，见图1；在能量供应的条件下，无EGCG时VCR在KB细胞内浓度ng是KBV200ng的倍,EGCG处理后，VCR浓度是原来的倍，接近KB细胞内水平，EGCG对KB细胞内的VCR浓度ng没有影响，见图2：撤去VCR培养2h，发现未用EGCG处理时KBV200细胞内VCR浓度明显降低，远低于同期的KB细胞，60min 时，8mg/L的EGCG显着抑制KBV200细胞内VCR的外排，但对 KB 细胞没有影响，见图3。 对肿瘤细胞Pgp表达的影响EGCG处理后的KBV200 Pgp表达下降,比单用VCR时Pgp表达水平低()， EGCG对KB细胞Pgp表达水平无明显作用()，见表2。表2EGCG对KB和KBV200细胞膜Pgp表达的影响(略)对裸鼠体重及抑瘤率的影响EGCG对裸鼠的体重没有影响，KB对照组移植瘤生长速度稍快于KBV200对照组，从专业角度考虑KBEGCG组抑瘤率，KBVEGCG组%无明显抑瘤和促瘤生长作用，EGCG联合VCR处理后可增强VCR对KBV200移植瘤的抑瘤作用；达到VCR对KB移植瘤的抑瘤作用%，而对KB移植瘤无明显影响，见表3，图4、5。表3 EGCG对KBV200及KB裸鼠移植瘤的抑瘤作用及几种耐药基因的影响(略)注：* ，*， VE组处有显着差异代表两种药物有相互作用。对几种多药耐药基因表达的影响MDR1 mRNA在对照组，VCR组有较高水平表达， EGCG可降低MDR1的表达量，见表2，图6。3讨论 本次发现EGCG体内外可耐受剂量可以逆转KBV200细胞对VCR的耐药性，增敏VCR的细胞毒作用，其抑瘤作用接近KB移植瘤。而EGCG在体外对多种肿瘤的耐药逆转作用机制众说不一，如有说可通过抑制Pgp功能逆转MDR细胞株 CH(R)C5、Caco2的耐药性，有提出EGCG对KBA1的 MDR的逆转效果可能与下调阿霉素诱导的细胞内活性氧簇的浓度有关，更有研究说绿茶提取物/ml不影响 LS180 细胞Pgp和MRP2的mRNA的表达，也没有证实EGCG可影响MRP2的活性。本实验应用叠氮钠阻滞细胞能量代谢后，药物进出细胞表现为被动转运，EGCG对KBV200细胞内VCR浓度没有影响；没有叠氮钠的情况下， KBV200细胞内VCR浓度低于KB细胞，EGCG作用后接近KB细胞水平；除去培养液中的VCR后， EGCG作用的KBV200细胞也表现出“蓄积”现象，提示EGCG 是抑制 Pgp对药物的泵出而发挥逆转作用。实验也显示EGCG在体内可降低MDR1 mRNA的表达，从而进一步降低Pgp的表达。综上可知， EGCG在体内外均可逆转KBV200的MDR作用，机制可能是降低MDR1的表达并影响Pgp的功能，从而提高细胞内VCR浓度。另外RTPCR结果发现， EGCG也降低了LRP在基因水平的表达，对MRP1则没有表现出明显的作用，而LRP在药物进出细胞核时发挥一定作用，至于其逆转作用是否存在其他作用靶点和机制，有待进一步探讨。 【参考文献】 1钟清木,叶韵斌,陈强，等.多药耐药基因在口腔鳞癌的表达及临床意义“J“.中国肿瘤临床与康复，2003，10：1720. 梁钢，张肃，黄志明，等.两种儿茶素成分体外逆转人肝癌细胞BEL7404/ADR 多药耐药性“J“.癌症，2004，23:401405.黎丹戎，涂文升，李力，等.肿瘤细胞中长春新碱的高效液相色谱法测定“J“.色谱,1998,16:，5052.Chen ZS,Kawabe T,Ono M,etof multidrug resistancereversing agents on transporting activity of human canalicular multispecific organic anion transporter“J“.Molecular Pharmacology,1999,56(6):12191228.Terez M,Gabor S,Katalin G,etvivo and in vitro multitracer analyses of Pglycoprotein expressionrelated multidrug resistance“J“.European Journal of Nuclear Medicine and molecular Imaging,2003,30(8):11471154.朱虹，陈孝平，罗顺峰，等.缺氧诱导因子1依赖性缺氧诱导人肝癌细胞多药耐药相关基因的表达及意义“J“.中华外科杂志,2005,43(5),277281.Jodoin J,Demeule M,Beliveauof the multidrug resistance Pglycoprotein activity by green tea polyphenols“J“.Biochim Biophys Acta,2002,1542(13):149159.Mei Y,Wei D,Liuof Multidrug Resistance in KB Cells with Tea Polyphenol Antioxidant Capacity“J“.Cancer Biol Ther,2005,4(4):468473.Netsch MI,Gutmann H,Luescheractivity of a green tea extract and some of its constituents on multidrug resistanceassociated protein 2 functionality“J“.Planta Med,2005,71(2):135141.