灰树花多糖协同化疗药物抗肿瘤作用及其分子机理初探.docx

灰树花多糖协同化疗药物抗肿瘤作用及其分子机理初探
【摘要】 目的 探讨灰树花β多糖在抗肿瘤细胞中的作用和协同化疗药物增加其杀伤肿瘤细胞的作用。另外通过对p53和MDM2的研究，发现了两者协同作用的分子机理。方法 用CCK-8方法测定了灰树花β多糖协同化疗药物处理HCT116后的细胞存活率(cell survival rate，CSR)；用PCR的方法测定了p53、MDM2基因的表达。结果 (1)灰树花β多糖对肿瘤细胞的直接杀伤作用高于灵芝多糖。(2)灰树花β多糖协同化疗药物增强其对肿瘤细胞的杀伤作用。(3)灰树花β多糖协同化疗药物的分子机理和抑制抑癌基因p53的拮抗物MDM2基因的表达相关。结论 灰树花β多糖具有直接杀伤肿瘤作用和化学药物协同抗肿瘤作用。

【关键词】 灰树花；化疗药物；p53；MDM2

【Abstract】 Objective The efficiency of anticancer therapy is limited by drug　studies suggest that a polysaccharide extracted from Grifola frondosa is able to kill cancer cells in vivo and in ， the molecular basis for the polysaccharide from Grifola frondosa synergistic effects with cytotoxic drugs has to be well　HCT116 cell survival rate were monitoued by CCK-8　and MDM2 gene expression were checked by semiquantitative PCR analysis of cellular　Here we showed the polysaccharide from Grifola frondosa had more great anti-cancer effect than shell-broken spores of G. lucidum in HCT116　the polysaccharide from Grifola frodosa was detected synergistic effects with cytotoxic drug (ADM). Conclusion We present the evidence that anti-apoptotic gene MDM2 expression may be involved in augented the polysaccharide from Grifola frondosa induced HCT116 cells sensitivity to ADM-treatment.

【Key words】 grifola frondosa；chemotherapeutic drug；p53；MDM2

灰树花(Grifola frondosa)是一种生长在亚热带至温带的大型药、食兼用珍稀食用菌，又名栗蘑、贝叶多孔菌等，日本称之为“舞茸”。在分类学上属担子菌纲多孔菌科，其口味鲜美、营养丰富，含有众多活性物质，灰树花多糖就是最主要的一类活性成分。灰树花多糖除含有β-1，6-支链β-1，3-葡聚糖外还含有大量高度分支化的β-1，3-支链β-1，6-葡聚糖，研究表明，这种特定的结构使其拥有更强的生物调节活性［６］。作为一种生物反应调节剂(BRM)，灰树花多糖具有增强免疫功能、抑制肿瘤、抗HIV病毒、稳定血压、降低血糖、改善脂肪代谢等广泛的生理活性［１］。

灰树花β多糖具有明显的抗肿瘤作用，能激活机体免疫细胞群如T淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞，并可促进多种细胞因子的分泌如IL-2、IL-8、IL-12、γ-INF、TNF-α等，增强肿瘤局部免疫反应，抑制肿瘤发生和转移［２～４］。

化疗药物对正常细胞的毒副作用在一定程度上限制了它对恶性肿瘤的治疗作用。

1 材料与方法

　细胞培养 用10%牛血清(PAA Laboratories Gmbh)DMEM(PAA Laboratories Gmbh)培养液在37℃、5%CO2条件下培养人肠癌细胞系HCT116。

　细胞毒性分析 取对数生长期HCT116细胞，常规消化成2×１０４/ml的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl DMEM细胞培养液。5%CO2、37℃ 环境中培养24h后对HCT116细胞分别用零处理；一天灰树花β多糖(3μg/ml)；一天2μg/ml化疗药物(阿霉素2μg/ml)；二天2μg/ml化疗药物(阿霉素2μg/ml)；第一天2μg/ml化疗药物(阿霉素2μg/ml)、第二天灰树花β多糖(3μg/ml)的五种不同的方法处理，次日每孔细胞中加入5μl的CCK-8试剂，5%CO2、37℃环境中培养2h后，在酶标仪上波长450nm处读取光密度A值，计算细胞存活率(cell survival rate，CSR)。
公式

　统计学处理 所有数据均以均数表示，采用t检验。

　RNA抽提和RT-PCT RNeasy kit (Qiagen)提取药物处理过的HCT116细胞总RNA并合成相应的cDNA，分别对p53和Mdm2作RT-PCR，PCR产物通过琼脂糖电泳观察结果。引物序列：p53正5′-GGCCATCTACAAGCAGTCAC-3′，p53反5′-GAGAGGAGCTGGTGTTGTTG-3′；Mdm2正5′-GGTGAGGAGCAGGCAATTG-3′，Mdm2反5′-GCGTCCCTGTAGATTCACTGC-3′。

2 实验结果

　灰树花β多糖直接抑制肿瘤细胞的作用 众所周知，灵芝破壁孢子粉是目前被广泛用于肿瘤患者辅助治疗各种肿瘤的一种保健药物。为了探究灰树花［１］对肿瘤细胞直接的杀伤作用［６～７］，我们用各种浓度的灵芝破壁孢子粉和灰树花β多糖对人的肠肿瘤细胞HCT116株进行处理，48h后测得肿瘤细胞HCT116的生存率，结果如图1所示，我们可以观察到与灵芝破壁孢子粉相比，灰树花β多糖对肿瘤细胞的杀伤作用更强大［８］，而且这种作用是随着剂量的递增而增强的。
图1 灰树花β多糖和灵芝破壁孢子粉对肿瘤细胞的直接抑制作用
用各种不同剂量的灰树花β多糖和灵芝破壁孢子粉
作用于处理HCT116细胞48h后，细胞生存率结果用
Cell Counting Kit-8检测获得 另外，在这个实验中我们所用的起始浓度非常低(从μg/ml)，由此可以判断灰树花β多糖从很低的浓度开始就有明显的杀伤肿瘤细胞的作用。

　灰树花β多糖对化疗药物的协同抗肿瘤作用 为了检测灰树花β多糖、化疗药物(阿霉素)以及二者一起使用的协同作用，我们对HCT116细胞分别用零处理；一天灰树花β多糖；一天化疗药物(阿霉素)；二天化疗药物(阿霉素)；第一天化疗药物(阿霉素)；第二天灰树花β多糖的五种不同的方法处理。次日再用CCK-8药盒测得HCT116细胞的生(残)存率，如图2所示：我们发现和零处理比较，单用灰树花β多糖有较弱的直接杀伤肿瘤细胞的能力(约为9%的杀伤力)，而化疗药物(阿霉素)单日和双日使用均有十分明显的杀伤肿瘤细胞的能力(约50%和78%的杀伤力)。而第一天用化疗药物(阿霉素)第二天再用灰树花β多糖处理，其二者的协同作用对肿瘤细胞有高达80%的杀伤力。众所周知，化疗药物(阿霉素)虽然对肿瘤细胞杀伤力强，但是毒副作用也十分明显。病人长期连续使用会严重影响其生活质量，也阻碍了治疗的深入进行。而灰树花本身是一种帮助调节和恢复各种身体机能的真菌多糖类滋补品。在本实验中，我们发现第一天用化疗药物处理，第二天改用灰树花β多糖的处理，不但没有减弱其直接对肿瘤细胞的杀伤能力(80%)，而且还能在临床应用时帮助恢复病人的整体机能和大大提高病人的生活质量。

在这实验中同时我们也测试了第一天用灰树花β多糖、第二天化疗药物(阿霉素)这样的顺序组合其协同作用的效果远远没有前一种顺序的强(只有50%的杀伤力，其实验数据未显示)。另外，除了阿霉素，我们还测试了其他多种临床上常用的化疗药物如：5-FU、CDDP、泰素等均有明显的协同作用。
图2 灰树花β多糖与化疗药物协同抗肿瘤作用
分别用灰树花β多糖3μg/ml和化疗药物(阿霉素)2μg/ml处理

HCT116细胞，细胞生存率结果用Cell Counting Kit-8检测获得 灰树花β多糖协同化疗药物抑制MDM2基因的表达 在这个实验中，人肠肿瘤HCT116细胞的抑癌基因p53表达为野生型。p53是一种非常重要的抑癌基因，它的功能主要表现为控制细胞的生长和促进细胞凋亡［１０，１１］。所以p53蛋白质又被称为“警戒蛋白”，在正常细胞中p53基因表达量是十分低下的，但是有些肿瘤细胞中p53的表达却异常高，HCT116细胞株就是一例。通常认为p53的表达异常高的肿瘤细胞中MDM2的量也十分高：即MDM2拮抗了p53的功能［
　　１２～１３］。本文为了研究灰树花β多糖和化疗药物抗肿瘤细胞协同作用的分子机理，我们用PCR方法，半定量化检测了p53基因和MDM2［１４～１６］基因在HCT116细胞中的表达。对HCT116细胞的处理是：零处理、1日灰树花β多糖、1日化疗药物(阿霉素)、2日化疗药物(阿霉素)；第一天化疗药物(阿霉素)；第二天灰树花β多糖处理五种不同方法。实验结果显示(图3)，HCT116细胞中p53基因的表达总体水平都十分高，但有趣的是，用灰树花β多糖处理后MDM2基因的表达下降，而且在第一天用化疗药物(阿霉素)第二天用灰树花β多糖处理后这种降低MDM2基因表达的作用被大大的增强了。图3 灰树花β多糖与化疗药物协同作用
对MDM2基因表达的影响
分别用灰树花β多糖3μg/ml和化疗药物(阿霉素)
2μg/ml处理HCT116细胞，抽提RNA用RT-PCR分析
p53和MDM2基因的表达，GAPDH作为对照 这样的实验结果让我们有理由相信在HCT116细胞中，第一天用化疗药物(阿霉素)；第二天用灰树花β多糖的处理方式在抗肿瘤作用中的协同作用是通过抑制抑癌基因的拮抗物MDM2基因的表达而实现的。

3 讨论

灰树花的抗肿瘤功效一直得到国际学术界的注目。尤其是灰树花β多糖在提高人体免疫机能等方面的研究更是层出不穷。但是灰树花β多糖和化疗药物协同抗肿瘤作用以及分子机理的研究却还有待开发。本研究中我们发现了灰树花β多糖直接杀伤肿瘤的作用高于目前被广泛使用的灵芝破壁孢子粉。另外灰树花β多糖和化疗药物的协同抗肿瘤作用也十分明显。通过更深入的分子生物学研究我们发现着名的抑癌基因p53和其拮抗蛋白MDM2基因的表达下降参与了这个作用。

p53是目前世界上被研究得最为透彻的抑癌基因。它的主要功能是当细胞由于外界因素而使DNA遭受损伤时，p53基因即被激活，由此而激活其下游的蛋白质p21(sip1/waf1/sidi1)的表达而使细胞停止生长并进行修复，而当DNA损伤严重时，p53又能启动其凋亡信号途径而导致细胞死亡。在正常细胞中p53的表达量非常低，而在有些肿瘤细胞中p53的表达却异常的高，这是因为这些肿瘤细胞中p53的拮抗蛋白MDM2的表达相当高、严重抑制了p53的正常功能。本研究中我们发现灰树花β多糖和化疗药物的协同作用可以大大地降低MDM2基因的表达。

发掘祖国医药宝库并且通过现代生物技术手段阐明其作用的分子机理是中医中药现代化的一条切实可行的途径。我们在这个研究中虽然只是初步的尝试，但是得到了一个令人振奋的结果。【参考文献】
1 Mayell　extracts and their therapeutic　Med，2001，6(1)：48-60.
2 Hishida I，Nanba H，Kuroda H. Antitumor activity exhibited by orally administered extract from fruit body of Grofola frondosa(maitake).Chem Pharm Bull，1987，36：1819-1827.
3 Kodama N，Harada N，Nanba H. A polysaccharide extract from Grifola frodosa，induces Th-1 dominant responses in carcinoma-bearing BALB/c mice. Jpn J Pharmacol，2002，90：357-360.
4 Kodama N，Komuta K，Nanba H. Effect of Maitake(Grifola frondosa)D-fraction of the activation of NK cells in cancer patients. J Med Food，2003，6(4)：371-377.
5 Kodama N， Komuta K，Nanba　glucan(MDFraction)can stop the cacer growth?In Proceedings of 3rd International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products，1999，199-203.
6 Adachi K，Nanba H，Kuroda　of host-mediated antitumor activity in mice by beta-glucan obtained from Grifola frondosa(maitake).Chem Pharm Bull(Tokyo)，1987，35：262-270.
7 Fullerton SA，Samadi AA，Tortorelis DG，et　of apoptosis in human prostatic cancer cells with beta-glucan(Maitake mushroom polysaccharide).Mol Urol，2000，4(1)：7-13.
8 Finkelstein MP， Aynehchi S， Samadi AA，et　of carmustine with Maitake β-glucan on androgen-independent prostatic cancer cells：involvement of glyoxalase I. J Altern Complement Med，2002，8：573-580.
9 Oda K， H. Arakawa H， Tanaka T， et al. p53 AIP1， a potential mediator of p53-dependent apoptosis， and its regulation by Ser-46-phosphorylated ，2000，102：849-862.
10 Wu GS，Burns TF，McDonald Ⅲ ER，et /DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor　Genet，1997，17：141-143.
11 Benchimol　pathways of　Death Differ，2001，8：1049-1051.
12 Freedman DA， Wu L，Levine　of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol Life Sci，1999，55：96-107.
13 Juven-Gershon T，Oren ：The ups and ，1999，5：71-83.
14 Grossman SR，Perez M，Kung AL，et /MDM2 complexes participate in MDM2-mediated p53　Cell， 1998，2：405-415.
15 Lane DP， Hall　of p53’s　Biochem Sci，1997，22：372-374.
16 Maya R，Balass M，Kim ST，et　phosphorylation of Mdm2 on serine 395：Role in p53 activation by DNA　& Dev，2001，15：1067-1077.
17 Soengas MS， Alarcon RM，Yoshid H，et　and caspase-9 in p53-dependent apoptosis and tumor ，1999，284：156-159.