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弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl
【摘要】 目的: 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl2/IgH基因重排与分子亚型生发中心样的相关性. 方法:采用自行设计的半巢式PCR对60例DLBCL的bcl2/IgH基因重排进行了检测，并对阳性产物进行克隆、测序. 同时采用免疫组化SP法在组织微阵列上同步观测CD20，CD10，Bcl6，黑色素瘤相关抗原1 (MUM1)的表达,进行GCB和非生发中心样(nonGCB)分子分类. 结果: 经常规法扩增bcl2/IgH，有6/60例DLBCL bcl2/IgH阳性；在6例阳性样本中,采用本组设计的半巢式PCR扩增，经克隆及测序证实5例bcl2/IgH基因重排阳性，1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段. 60例DLBCL CD20表达全部阳性；CD10，Bcl6， MUM1的阳性表达率分别为%，%，%；GCB 32例，nonGCB 28例. bcl2/IgH基因重排阳性的病例均属GCB分子亚型, 且与CD10表达有显着性相关，而与Bcl6及MUM1表达无相关性. 结论:使用本组设计的半巢式PCR可提高bcl2/IgH基因重排检测的准确性. bcl2/IgH基因重排的检测可协助确定部分GCB分子亚型的DLBCL.
【关键词】 弥漫性大B细胞淋巴瘤； bcl2; 基因重排
0引言
弥漫性大B细胞淋巴瘤是最常见、高度恶性的非霍奇金淋巴瘤，但新近cDNA芯片的研究结果显示，该瘤存在生发中心样和非生发中心样两种分子亚型，GCB的预后明显好于nonGCB类型［1-2］. Hans等［3］以cDNA芯片为参照标准，发现利用“套餐”式免疫标记物CD10，Bcl6，黑色素瘤相关抗原1 ［melanoma associated antigen(mutated)1, MUM1］也可以对DLBCL进行分子分类. bcl2/IgH基因重排是人类恶性淋巴瘤最常见的染色体异常，存在bcl2基因重排的病例有较好的生存率. 我们利用组织微阵列(tissue microarray, TMA)技术对60例DLBCL进行分子分类, 采用PCR技术检测bcl2/IgH基因重排，探究bcl2/IgH基因重排与分子亚型的相关性，旨在为临床判断DLBCL的预后提供
1．1材料1999/2003年诊断明确资料齐全的DLBCL 60例，中位年龄岁，所有标本均为40 g/L中性甲醛固定, 常规石蜡切片HE染色. 由3名专门从事淋巴瘤研究的医师按新的WHO分类方法进行诊断. SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司; CD20购于福州Maxim公司；CD10购于美国Zymed公司；Bcl6购于美国Neomarker公司； MUM1 mAb由意大利Perugia大学血液病研究所Dr. Falini馈赠.
1．2方法
1．/IgH基因重排的检测DNA提取采用我室建立的石蜡切片刮片法，每例切片1张，厚3 μm，常规脱蜡、干燥. 用无菌刀片刮入Eppendorf管，加入50 μL消化液(10 mmol/L , 1 mmol/L EDTA, 200 mL/L Tween 20)，同时加入蛋白酶K，56℃水浴孵育过夜，充分消化后，98℃, 10 min灭活蛋白酶K，12 000 g离心10 min，分装上清液，用分光光度计检测DNA的浓度，将浓度调整至200～400 μg/L，-20℃保存备用.
1．2．2半巢式PCR检测bcl2/IgH基因重排bcl2/IgH 基因重排的检测采用半巢式PCR. 第一次扩增PCR引物为：上游:MBR 5′TTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTG3′; 下游JH1: 5′ACCTGAGGAGACGGTGACC3′. 该对引物为检测bcl2/IgH 基因重排常用引物［4］. 利用专业的引物设计软件Primer premier, 我们在MBR下游设计了第二重引物: Mbr1 5′CAACACAGACCCACCCAGAG3′与原下游引物JH1构成半巢式PCR反应的第二对引物. 反应体系为:10×PCR 缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2　μL, 10 mmol/L dNTP　μL,上下游引物各 μL,Taq DNA聚合酶 μL，模板1 μL(浓度200~500 mg/L),三蒸水 μL,总反应体系为20 μL. 半巢式PCR的反应体系为10×PCR缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2　μL, 10 mmol/L dNTP　μL,上下游引物各1 μL, Taq DNA聚合酶 μL，模板1 μL,三蒸水 μL.反应条件为95℃变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共35个循环，然后，72℃终末延伸10 min，4℃保存30 min. 半巢式PCR模板为一步法的产物稀释100倍. 产物以20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭 μL染色. 所有PCR操作过程中严格按PCR操作规程进行. 阳性对照采用经测序证实为基因重排阳性的DNA，阴性对照为双蒸水. PCR阳性产物经TA克隆连于T载体，送上海博亚公司进行测序. 测序采用3730测序仪，DNA测序技术主要依据Sanger双脱氧链终止法. 测序结果在基因库中进行比对，以明确是否为 bcl2/IgH 基因重排片段.
制作首先对60例DLBCL蜡块组织的苏木精-伊红染色切片作形态学观察，选择有代表性的肿瘤区域，在相应位置进行标记；然后使用组织微阵列仪制作受体蜡块并打孔，根据原有切片的标记部位，用供体针在蜡块相应部位取样，所用组织芯直径为 mm，将供体组织芯放入受体蜡块. 每例标本在标记区域内随机取2~4条组织芯. 在组织样本填入蜡孔时记录每个样本在二维阵列中的具体位置，并在一定位置上标记出TMA的方位.
免疫组化染色采用SP法进行免疫组化染色. 以CD20染色来判断每个组织点的肿瘤细胞数，每例标本以肿瘤细胞数最多的点作分析. 抗体的阳性判断标准为：CD20，CD10阳性定位于细胞膜，Bcl6，MUM1阳性定位于细胞核, 20%的肿瘤细胞染色判为阳性［3］. 采用CD10， Bcl6和MUM1 3种抗体对DLBCL进行分类［3］. CD10， Bcl6作为生发中心细胞的标志物，CD10+或CD10+/Bcl6+为GCB类；CD10-/Bcl6-为nonGCB类；MUM1作为后生发中心细胞来源的标志物，若CD10-/Bcl6+，则用MUM1来分类：MUM1+为nonGCB类，MUM1-为GCB类.
统计学处理: 使用SPSS 软件,对数据进行Fisher精确检验.
　　2结果
2．1组织学分型根据WHO新分类方法对DLBCL进行分型，中心母细胞型(centroblastic，CB) 53例(%)，免疫母细胞型3例(%)，间变性大B细胞型. 经统计学分析，年龄性别等因素与CD20, CD10, Bcl6表达无关.
2．3DLBCL TMA分子分类60例DLBCL中， 32例GCB，28例nonGCB. 在32例GCB类中， 26例CD10+，18例Bcl6+，14例 CD10+/Bcl6+， 6例(%) CD10-/Bcl6+. 在28例nonGCB类中，24例MUM1+，8例 MUM1+/Bcl6+.A：细胞膜CD20+ ×100; B：细胞核Bcl6+ ×100; C: 细胞膜CD10+ ×200; D: 细胞核MUM1+ ×100.
图1弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫组化染色SP
2．4基因重排检测因bcl2/IgH基因断裂在不同病例略有差异，所以扩增出的片段为100～300 bp(图2). 经一步法扩增，发现6例阳性，对阳性样本进行半巢式PCR扩增时发现5例基因重排阳性，考虑一步法扩增有假阳性，经克隆及测序证实为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段，其序列为: TTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTGCCTCTCTCACCT
CCCAGGTGAACGGTGTGGACATGAAGCTGCCCGTGG
TGCTGGCCAACGGCCAGATCCGTGCCTCCCAGCATG
GTTCAGATGTTGTGATTGAGACCGACTTCGGCCTGCG
TGTGGCCTACGACCTTGTGTACTATGTGCGGGTCACC
GTCTCCTCAGGT, 因此bcl2/IgH基因重排为5例. 基因重排阳性的5例病例均为GCB亚类. CD10阳性及阴性病例bcl2/IgH基因重排的发生率分别为%(5/26)及0%(0/34)，有统计学差异(表1).
表1弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫组化与临床资料及bcl2/IgH基因重排关系(略)
图2PCR检测bcl2/IgH重排
3讨论
本组60例DLBCL，CD10的阳性率高于西方Hans等［3］的28%和Colomo等［4］的21%, 可能与本组选用的病例多为CB变型的B细胞淋巴瘤有关. CD10诊断GCB的敏感性较低，经CD10和Bcl6联合应用，在GCB类中发现了6例CD10阴性、Bcl6阳性，说明联合应用CD10及Bcl6可提高GCB亚类的检出率. 本组检测MUM1阳性率与文献报道相近［5-6］. 我们使用传统引物进行bcl2/IgH基因重排检测发现的阳性样本，采用本组设计的半巢式PCR扩增及克隆、测序证明有1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段，该片段的上下游分别有9个碱基能与传统引物互补配对，因此进行PCR时可能将其扩增出来，而非真正的基因重排. 这可能是传统引物检测重排发生假阳性的分子生物学基础. 结果显示采用我们所设计的半巢式PCR引物检测bcl2/IgH基因重排可有效的避免假阳性的发生. 在我们的研究中，所有存在bcl2基因重排的病例均表达CD10，统计学资料表明二者存在相关性，因此通过对bcl2基因重排的检测可确定部分GCB类的DLBCL. 这部分DLBCL与其它类型的DLBCL相比可能有不同的发病机制，属不同的疾病亚型［7-8］. 正确的检测方法对这种疾病的正确诊断有着重要意义，我们使用的半巢式PCR提高了诊断重排的准确性.本研究在进行免疫组化过程中，我们采用了TMA技术，由于所有标本均在一张切片上进行免疫组化染色，人为误差少，一致性更强，有助于在同一水平进行观察分析和比较研究，因此本研究的免疫组织化学染色结果是可靠的.
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